一种来源于钝齿棒杆菌的2,3-丁二醇脱氢酶或乙偶姻还原酶的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种来源于钝齿棒杆菌的2, 3- 丁 二醇脱氢酶（乙偶姻还原酶）。
【背景技术】
[0002] 3-羟基丁酮（又名乙偶姻）是一种重要的风味物质和平台化合物，在食品、化工、 医药等行业具有广泛的用途。自然界很多微生物都可以代谢生产乙偶姻，目前用来发酵 生广2, 3- 丁二醇的微生物主要是细囷类，包括克雷伯氏囷属（Klebsiella)、牙抱杆囷属 (Bacillus)、肠杆菌属（Enterobacter)和沙雷氏菌属（Serratia)等。虽然自然界有很多 菌株都可以合成乙偶姻，但是在这些菌株中乙偶姻往往是作为2, 3- 丁二醇的副产物存在。 而且以上菌株有些属于致病菌株，无法用于工业上的大规模生产。
[0003] 2, 3- 丁二醇脱氢酶，又称乙偶姻还原酶。隶属于氧化还原酶，催化2, 3- 丁二醇和 乙偶姻之间的相互转化，能够在NADH存在的情况下催化乙偶姻生成2, 3- 丁二醇，同时在 NAD+存在的情况下催化2, 3-丁二醇可逆形成乙偶姻。在钝齿棒杆菌中并未见2, 3-丁二醇 脱氢酶及其相关性质的研究。钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5是一种从 土壤中分离并经紫外诱导获得的安全的，需氧的，革兰氏阳性，不产孢子的，组氨酸营养缺 陷型的工业细菌。本发明中所用的C. crenatum SYPA 5-5通过16S rDNA鉴定后，其与谷氨 酸棒杆菌 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 同源性达 99. 4%。
[0004] 本发明通过表达载体pET_28a(+)，实现2, 3-丁二醇脱氢酶基因在大肠杆菌 E. coli BL21中进行表达，并通过利用Ni-NTA亲和层析方法纯化得到纯酶，进行酶学性质 研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是鉴定钝齿棒杆菌中的2, 3- 丁二醇的脱氢酶，并对其酶学性质进 行研究
[0006] 本发明获得的2, 3 丁二醇脱氢酶基因（butA)，包含有777bp的基因，编码一个由 258个氨基酸组成的蛋白质。
[0007] 本发明还提供用于表达上述2, 3- 丁二醇脱氢酶基因的重组表达质粒，是将序列 为SEQ ID NO. 2的核苷酸片段插入到原核表达载体上构建的。所述的原核表达载体为 pET_28a(+)〇
[0008] 本发明还涉及携带有表达上述2, 3-丁二醇脱氢酶的重组表达质粒的重组菌 E.coli BL21/pET-28a(+)-butA〇
[0009] 本发明提供了一种来源于钝齿棒杆菌的2, 3- 丁二醇脱氢酶，所述2, 3- 丁二醇 脱氢酶最适作用温度为35°C，对温度比较敏感，在高于35°C的温度下酶活力迅速下降，在 40°C基本检测不到酶活；最适反应pH氧化方向为10. 0,还原方向为4.0 ;双乙酰是除了乙 偶姻之外，2, 3- 丁二醇脱氢酶还原方向重要的底物之一。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 :2, 3- 丁二醇脱氢酶引物设计
[0011] 根据NCBI谷氨酸棒状杆菌全基因组核酸序列中butA基因序列，设计2, 3- 丁二醇 脱氢酶基因的PCR引物Pl和P2。
[0012] Pl :5' -ACCGGAATTCATGAGCAAAGTTGCAATGGT-3'（EcoR I)
[0013] P2 :5' -ACCGAAGCTTCTAGTTGTAGAGCATGCCGC-3' （Hind III)
[0014] 实施例2 :2, 3- 丁二醇脱氢酶基因的克隆
[0015] 以Corynebacterium crenatum SYPA5-5总DNA为模板，利用上面提供的引物做 PCR扩增，扩增条件为：94°C预变性，5min，一个循环；94°C变性，lmin，57°C退火，lmin，72°C 延伸，90s，30个循环；72°C，10min，一个循环；15°C，10min，一个循环。PCR扩增体系：模 板2yL，上下游引物各0.5yL，dNTP Mix 4yL，10XEx Taq Buffer 5yL，灭菌的双蒸水 37yL，Ex Taq DNA聚合酶lyL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检 验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20°C冰箱保存备用。回收产物 与PMD18-T Vector连接，连接产物转化E. coil JM109,转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平 板，经37°C培养过夜，挑取菌落到IOmL液体LB培养基中，37°C摇床过夜培养后提取质粒，命 名为pMD18-T-butA，经酶切验证连接成功后，加入甘油至终浓度15%~20% (w/v)，-40°C 冰箱保藏。
[0016] 实施例3 :重组质粒pET-28a(+)-butA在大肠杆菌BL21中的构建
[0017] 提取保存于 E. coli JM109 中的质粒 pMD18-T-butA 和 pET-28a(+)，并分别用 EcoR I和HindIII进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系：目的基因酶切 产物 7 μ L，pET-28a (+)酶切产物 1 μ L，T4DNA 连接酶 buffer 1 μ L，T4DNA 连接酶 1 μ L，16°C 过夜连接。将连接好的重组质粒pET-28a(+)-butA转化到感受态E. coil BL21，用卡那霉素 LB平板，挑取阳性菌落。37°C摇床过夜培养后提取质粒，命名为pET-28a (+)-butA，酶切验 证正确后，加入甘油至终浓度15%~20% (w/v)，-40°C冰箱保藏备用。
[0018] 实施例4 :重组菌E. coli BL21/pET-28a(+)-butA 2, 3- 丁二醇脱氢酶活力测定
[0019] 将实施例3中构建的重组菌E. coli BL21/pET-28a(+)-butA与原始菌E. coli BL21分别接种于IOmL含卡那霉素的LB培养基中，200rpm，37°C振荡培养8h，按1%的接种 量转接于LB培养基中，37°C培养至菌体OD值达0. 6时加0. 5mM的IPTG进行诱导7h，然后 取发酵液于4°C，lOOOOr/min离心10min，pH7. 0的磷酸钠缓冲液清洗3次，悬浮在pH 7. 0 的50mM磷酸钠缓冲液（含0.1 mM β -巯基乙醇，2 μ g/ml PMSF)中，超声波破碎处理制备粗 酶液。
[0020] 酶活力测定缓冲体系：
[0021] 乙偶姻还原酶：0. 05M乙偶姻，50mM磷酸钠缓冲液pH 4. 0, 5mM NAD+ ;
[0022] 2, 3- 丁二醇脱氢酶：0· IM 2, 3- 丁二醇，50mM 磷酸钠缓冲液 pH 10. 0, 5mM NADH ;
[0023] 结果表明重组菌E. coli BL21/pET-28a(+)-butA中2, 3- 丁二醇脱氢酶还原方向 的比酶活为0. 44U/mg，氧化方向的比酶活为0. 07U/mg。
【主权项】
1. 一种2, 3- 丁二醇脱氢酶，又称乙偶姻还原酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为 SEQIDNO. 1。2. 如权利要求1所述的2, 3- 丁二醇脱氢酶，其特征在于来源于Corynebacterium crenatumSYPA5-5,所述酶的基因序列为SEQIDN0.2。3. -种重组表达质粒，其特征在于所述的重组表达质粒携带有权利要求2所述的基 因，原核表达载体为pET-28a(+)。4. 一种重组大肠杆菌基因工程菌，其特征在于包含权利要求3所述的重组表达质粒。
【专利摘要】一种来源于钝齿棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶(乙偶姻还原酶)的鉴定，属于基因工程和酶工程领域。本发明提供了一种2,3-丁二醇脱氢酶，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO.1，本发明通过表达载体pET-28a(+)，实现2,3-丁二醇脱氢酶基因在大肠杆菌E.coli？BL21中进行表达，结果表明重组大肠杆菌中2,3-丁二醇脱氢酶还原方向的比酶活为0.44U/mg，氧化方向的比酶活为0.07U/mg。
【IPC分类】C12N15/70, C12R1/19, C12N15/53, C12N9/04, C12N1/21
【公开号】CN105176941
【申请号】
【发明人】饶志明, 赵晓静, 张显, 李欣, 杨套伟, 徐美娟
【申请人】江南大学, 江南大学（如皋）食品生物技术研究所, 如皋江大食品生物技术研究所有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月24日