一种敲除argCJBD提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种敲除argCJBD提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方 法，属于遗传工程领域。
【背景技术】
[0002] 乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及 动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软 骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加 来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目 前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污 染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
[0003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化 学品的生产宿主，其产品被FDA认证为"generally regarded as safe"（GRAS)安全级别。 因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效 途径。然而，在氨糖合成过程中，L-Gln作为乙酰氨基葡萄糖合成的氨基供体，其代谢流被 L-Pro和L-Arg竞争性削弱。
【发明内容】
[0004] 本发明首先提供一种敲除了 argCJBD的重组枯草芽孢杆菌，是以 BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl 为出发菌株，敲除了 argC、argj、argB、argD，阻断宿主菌由谷氨 酸生成精氨酸的途径，构建而成的重组枯草芽孢杆菌。
[0005] 所述 BSGN6-PxylA-glmS_P43-GNAl，是以 B. subtilisl68 Δ nagP Δ gamP Δ gamA Δ nagA Δ nagB Δ Idh Δ pta: : 1οχ72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNAl的重组表达。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P 43-GNAl的构 建方法参见文南犬 Liu, Y. et al. Modular pathway engineering ofBacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production. Metab. Eng. 23:42-52, 2014。
[0007] 所述由谷氨酸生成精氨酸的途径，包括乙酰谷氨酸半醛脱氢酶、鸟氨酸乙酰转移 酶、乙酰谷氨酸激酶、乙酰鸟氨酸转氨酶。
[0008] 所述乙酰谷氨酸半醛脱氢酶编码基因如NCBI-Gene ID:936389所示，鸟氨酸乙 酰转移酶编码基因如NCBI-Gene ID :939800所示，乙酰谷氨酸激酶编码基因如NCBI-Gene ID :936381所示，乙酰鸟氨酸转氨酶编码基因如NCBI-Gene ID :939357所示。
[0009] 本发明还提供了构建所述重组枯草芽孢杆菌的方法，是以 BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl为出发菌株，通过同源重组敲除了 argCJBD，阻断宿主菌由谷氨 酸生成精氨酸的途径。
[0010] 本发明还提供了应用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，将 37°C、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5%的接种量转入发酵培养基，同时加入 5g/L木糖作为诱导剂，于37°C、200rpm条件下发酵30h。
[0011] 重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：
[0012] 种子培养基（g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5, NaCl 10。
[0013] 发酵培养基（g/L) :Glc 60,酵母粉 6, NH4S047 . 74, K2HPO4 · 3H20 12. 5, ΚΗ2Ρ042· 5， CaC035，MgS043,微量元素 15ml/L。
[0014] 微量元素溶液（g/L) :MnS04 · 5H20 I. 0, Cocl2 · 6H20 0· 4, NaMoO4 · 2H20 0· 2， ZnSO4 · 7Η200· 2, Alcl3 · 6H20 0· 1，Cucl2 · H2O 0· 1，H3BO40.0 5,含 5M HC1。
[0015] 培养条件：将37°C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基，于 37°C、200rpm条件下培养30h。
[0016] 本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl作为出发菌株，通过同 源重组敲除乙酰谷氨酸半醛脱氢酶编码基因（argC)、鸟氨酸乙酰转移酶编码基因（argj)、 乙酰谷氨酸激酶编码基因（argB)和乙酰鸟氨酸转氨酶编码基因（argD)，阻断了宿主菌由 谷氨酸生成精氨酸的途径，促进谷氨酸转化为谷氨酰胺的反应，而谷氨酰胺是乙酰氨基葡 萄糖合成的氨基供体，从而提高乙酰氨基葡萄糖的产量。在使用半合成培养基的摇瓶发酵 过程中，敲除argCJBD的重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖的产量达到6. 4g/L，比敲除前 提高16. 3%。本发明为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本 发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
【具体实施方式】
[0017] 乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
[0018] 高效液相色谱（HPLC)检测法=Agilent 1260, RID 检测器，HPX-87H 柱（Bio-Rad Hercules, CA)，流动相：5mM H2SO4，流速 0. 6mL/min，柱温 35°C，进样体积为 10 μ L。
[0019] 实施例1敲除乙酰谷氨酸半醛脱氢酶编码基因（argC)、鸟氨酸乙酰转移酶编码基 因（argj)、乙酰谷氨酸激酶编码基因（argB)和乙酰鸟氨酸转氨酶编码基因（argD)
[0020] 根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 168,购自美国典型微 生物保藏中心，ATCC No. 27370)乙酰谷氨酸半醛脱氢酶编码基因 argC和乙酰鸟氨酸转 氨酶编码基因 argD上下游序列，设计敲除框同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为： argl-L-F :5' -GCCGACCTTTCCTATGCGAAGGAC-3' 和 argI-L-R :5' -CTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTA TCCGCTCAACMGTTCACCCTCTTGGTCTTTGTGAA-3';右臂上下游引物分别为：argl-R-F: 5'-GTCGT GACTGGGAMACCCTGGCGCTCATCATTCCGCTGTAAACCAGTGA-3 ' 和 argl-R-R: 5 ' -CGCGAGCGCGATCAGC TGATG-3'。运用上述引物从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 168)基因组中扩增敲除框中 包含的左臂和右臂。根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列（NCBI accession no. EU541492)， 设计引物，扩增博来霉素抗性基因（zeo)，上下游引物分别为：argl-Z-F:5' -TTCACAAAGACC AAGAGGGTGAACTTGTTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3 ' 和 argl-Z-R: 5 ' -TCACTGGTTTACA GCGGAATGATGAGCGCCAGGGITTTCCCAGTCACGAC-3 '。通过融合 PCR 方法，将敲除框左、右臂及抗 性基因融合为敲除框。通过测序确认argCJBD敲除框构建成功。
[0021 ] 实施例2重组枯草芽孢杆菌的构建
[0022] 将构建好的敲除框转化枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P 43-GNAl，通过博来霉素 抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认argCJBD敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGN6 △ arg CJBD: :l〇X72-PxylA-glmS-P43-GNAl。枯草芽孢杆菌 BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl 的构建方法参 见文南犬Liu，Y.et al. Modular pathway engineering ofBacillus subtilis for improved N-acetyIglucosamine production. Metab. Eng. 23:42-52, 2014。
[0023] 实施例3发酵生产乙酰氨基葡萄糖
[0024] 将37°C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基，于37°C、 200rpm条件下培养30h。发酵30h，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到6. 4g/L。通过 敲除argCJBD，阻断了宿主菌由谷氨酸生成精氨酸的途径，促进谷氨酸转化为谷氨酰胺的反 应，积累乙酰氨基葡萄糖合成需要的氨基供体，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆 菌胞外产量的提高，比敲除前提高16. 3%。
[0025] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌 BSGN6-P xylA-glmS-P43-GNAl为出发菌株，敲除了乙酰谷氨酸半醛脱氢酶的编码基因argC、鸟 氨酸乙酰转移酶的编码基因argj、乙酰谷氨酸激酶的编码基因argB和乙酰鸟氨酸转氨酶 的编码基因argD。2. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌 BSGN6-PxylA-glmS_P 43-GNAl，是以 B. subtilis 168AnagPAgamPAgamAAnagAAnagBAIdh Apta: : lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43调控glmS、gnal表达。3. -种构建权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，构建argCJBD 敲除框，通过同源重组将敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代重组枯草芽孢杆菌 BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl 基因组中的 argCJBD〇4. 应用权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特 征在于，将37°C、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5%的接种量转入发酵培养基， 同时加入5g/L木糖作为诱导剂，于37°C、200rpm条件下发酵30h。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基按每L计含有：葡萄糖 60g，酵母粉 6g，NH4SO4 7. 74g，K2HPO4 ? 3H20 12. 5g，KH2PO4 2. 5g，CaCO3 5g，微量元素溶液 15ml;微量元素溶液按g/L计含有：MnS04 ? 5H20I. 0,CoCl2 ? 6H20 0? 4,NaMoO4 ? 2H20 0? 2， ZnSO4 ? 7H20 0? 2,AlCl3 ? 6H20 0? 1，CuCl2 ?H2O0? 1，H3BO4 0? 05,含 5MHC1。
【专利摘要】本发明公开了一种敲除argCJBD提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传工程领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1作为出发菌株，通过同源重组敲除乙酰谷氨酸半醛脱氢酶编码基因(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶编码基因(argJ)、乙酰谷氨酸激酶编码基因(argB)和乙酰鸟氨酸转氨酶编码基因(argD)，阻断了宿主菌由谷氨酸生成精氨酸的途径，促进谷氨酸转化为谷氨酰胺的反应，而谷氨酰胺是乙酰氨基葡萄糖合成的氨基供体，从而提高乙酰氨基葡萄糖的产量。在使用半合成培养基的摇瓶发酵过程中，敲除argCJBD的重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖的产量达到6.4g/L，比敲除前提高16.3％。为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
【IPC分类】C12R1/125, C12N1/20, C12P19/26
【公开号】CN105176879
【申请号】
【发明人】刘龙, 陈坚, 堵国成, 李江华, 马文龙, 武耀康
【申请人】江南大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月14日