亚硝酸菌的高通量筛选方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于微生物技术领域，涉及一种亚硝酸菌的高通量筛选方法。
【背景技术】
[0003] 由于氮(特别是氨氮）是水体富营养化污染的主要原因之一，"硝化-反硝化"是最 常见的水体脱氮过程，也广泛应用于污水处理和地表水的治理中。多数研究表明，"硝化-反 硝化"过程中，"硝化"是常见的限速步骤，其中又以"亚硝化"（将氨氮氧化为亚硝酸盐）的 限速效应最为明显，因此分离筛选高效的亚硝酸菌对于提高污水处理和地表水的治理中的 脱氮效果有重要意义。
[0004] 目前，从环境中分离筛选亚硝酸菌的过程包括：1、先通过至少3轮的平板划线(采 用接种针/环实现）才能获得纯的亚硝酸菌菌落；2、对分离得到的每一株纯化菌株均需通 过专门的脱氨氮试验才能初步确定该纯化菌株的亚硝化能力。综上所述，分离筛选亚硝酸 菌至少要对亚硝酸菌连续培养4代，在此过程中，仅有不到1%的菌株具有亚硝化活性，如此 低的效率意味着超过99%的人力、物力和时间的消耗是不能得到回报的！因此，研发亚硝 酸菌的高通量筛选技术，替代基于传统接种针/环的常规筛选技术，对于提高亚硝酸菌的 筛选效率具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于克服传统亚硝酸菌分离筛选效率低，周期长，工 作量大的缺点，提供一种高通量的亚硝酸菌的筛选方法。
[0006] 使用的接种影印工具，包括圆盘状、同样大小的底板、中间板和面板，它们通过边 缘上均匀分布的四根不锈钢螺丝固定，在四根不锈钢螺丝外套铜螺柱，底板、中间板、面板 的中心与一手柄通过螺母固定连接；在中间板和面板上有1448个小孔，有10~1448根平头 不锈钉穿过中间板和面板的小孔，且钉头在底板和中间板之间可上下移动。
[0007] 筛选亚硝酸菌的样品为黑臭河水，具体过程包括如下步骤： (1) 平板影印接种菌 取在121°C的温度下灭菌的IOcm培养皿放入洁净工作台中紫外线照射30分钟，取黑 臭河水倒入清洁的灭菌培养皿内，用所述接种影印工具沾取菌悬液后放置于事先制备好的 经灭菌的IOcm培养皿上，用记号笔在接种影印工具定位孔对应的培养皿边缘做定位孔标 记，盖上平皿盖25°C倒置培养； (2) 平板影印传代 待菌落明显又尚未黏连融合时，采用无菌操作，用同一接种影印工具的定位孔对准培 养皿上的定位孔标记，放下接种影印工具，不锈平头钉上将沾染原平板上对应的菌落，再 转印于另一个经灭菌的黑臭河水平板上进行传代，盖上皿盖25°C倒置培养，将原代平板于 4°C保藏待用。
[0008] (3)亚硝酸菌菌落识别 用直径95mm的玻璃纤维滤膜浸润亚硝氮显色液后，将其紧贴至子代平板表面，记录贴 膜10分钟时有红色色斑出现的菌落，在原代平板上挑取同一菌落，采用平板划线法分离纯 化亚硝酸菌。
本发明方法与传统技术比较如上表所示。
【附图说明】
[0010] 图1，接种影印工具结构示意图。
[0011] 图2,原代平板。
[0012] 图3，子代平板。
[0013] 图4显色为红斑的菌落（圈内菌落）。
【具体实施方式】
[0014] 1、材料 分离微生物的样品来源：来自湖北省某黑臭河道。
[0015] 培养基：黑臭河水，通过加入氯化氨将其氨氮浓度调节为10mg/L，对应的固体培 养基琼脂粉含量为1.6%。
[0016] 亚硝氮显色液：将21ml的浓盐酸和Ig的磺胺加入到约75ml去离子水中，溶解完 全(须加热)，加入0.1 g的N-(1-萘基1)乙二胺二盐酸，用去离子水稀释至100ml，混合均 匀，避光4°C冷藏备用，该显色液与亚硝酸盐反应后呈红色。
[0017] 2、接种影印工具： 包括圆盘状、同样大小的底板、中间板和面板，它们通过边缘上均匀分布的四根不锈钢 螺丝固定，在四根不锈钢螺丝外套铜螺柱，底板、中间板、面板的中心与一手柄通过螺母固 定连接；在中间板和面板上有1448个小孔，有10~1448根平头不锈钉穿过中间板和面板的 小孔，且钉头在底板和中间板之间可上下移动。
[0018] 中间板与底板的距离是4mm。
[0019] 中间板与面板的距离是8mm〇
[0020] 所述底板、中间板、面板厚I. 6mm，直径95mm。
[0021] 平头不锈钉长30± 1mm，直径1mm。平头不锈钉10~1448根，根据微生物菌落大小 自由调节，为避免菌落互相黏连融合同时兼顾分离效率，菌落较大时针数应较少，菌落较小 时针数应较多。
[0022] 3、平板影印接种菌(制备原代平板） 取在121°C的温度下灭菌的IOcm培养皿放入洁净工作台中紫外线照射30分钟，取黑臭 河水>10mL倒入清洁的灭菌培养皿内，用接种影印工具沾取菌悬液后放置(依靠工具的自 身重力，无需按压）于事先制备好的经灭菌的黑臭河水固体平板（IOcm培养皿）上，用记号 笔在接种影印工具定位孔对应的培养皿边缘做定位孔标记，盖上平皿盖25°C倒置培养。
[0023] 4、平板影印传代(制备子代平板） 待平板中菌落长到适当大小(菌落明显但又尚未黏连融合)，采用无菌操作，用同一接 种影印工具的定位孔对准培养皿上的定位孔标记，放下接种影印工具(依靠工具的自身重 力，无需按压)，钢针针头上将沾染原平板上对应的菌落，再转印于另一个经灭菌的黑臭河 水平板上进行传代(依靠工具的自身重力放置即可，同时做定位孔标记)，盖上平皿盖25°C 倒置培养。影印完成后，将原代平板于4°C保藏待用。
[0024] 5、亚硝酸菌菌落识别： 用直径95mm的玻璃纤维滤膜(孔径不限)浸润亚硝氮显色液后，将其紧贴至子代平板表 面，记录贴膜10分钟时有红色色斑出现的菌落（10分钟时效果最佳，30分钟后会褪色），在 原代平板上挑取同一菌落采用常规平板划线法分离纯化亚硝酸菌。
【主权项】
1. 亚硝酸菌的高通量筛选方法，其特征在于：1)、菌落的高通量分离；2)、菌落生成亚 硝酸效果的高通量检测与亚硝酸菌的分离。2. 根据权利要求1所述的方法，菌落的高通量分离的特征在于：采用以铵氮为唯一氮 源的培养基，结合接种影印工具接种1次获得原代平板，再传代1次获得子代平板。3. 根据权利要求1所述的方法，菌落生成亚硝酸效果的高通量检测与亚硝酸菌的分离 的特征在于：采用贴膜法使显色剂与子代平板上的菌落接触，在30分钟内观察菌落显色反 应(红色）直观识别阳性菌落，再从原代平板上挑取相应位置的原代菌落(此菌落中即包含 有亚硝酸菌）进行划线纯化。
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，涉及一种亚硝酸菌的高通量筛选方法。包括1）、菌落的高通量分离；2）、菌落生成亚硝酸效果的高通量检测与亚硝酸菌的分离。本发明方法是亚硝酸菌的高通量筛选技术，可替代基于传统接种针/环的常规筛选技术，对于提高亚硝酸菌的筛选效率具有重要意义。
【IPC分类】C12N1/20
【公开号】CN105176865
【申请号】
【发明人】程凯, 曾雅雯, 罗娟, 黄乐滔, 田俊泽, 魏雪梅, 向斯
【申请人】湖北工业大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月17日