ine :sigma#V900471 〇
[0077] 制备碱基混合标准液：依次使用胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤配制混 合标准液，混合标准液碱基的浓度依此为16. 00ug/ml、16. 00ug/ml、20. 00ug/ml、16. OOug/ ml、16. 00ug/ml。分装至0· 5ml冻存管内，-20°C保存，有效期一年。
[0078] 仪器与设备：
[0079] 高效液相色谱仪系统（梯度洗脱、紫外检测、可控柱温）。
[0080] 色谱柱：Athena C18,4. 6 X 150mm〇
[0081] 分析天平。
[0082] 离心机。
[0083] 超声清洗器。
[0084] ImL -次性注射器。
[0085] 0· 45um -次性水相过滤器。
[0086] 0.5ml 离心管。
[0087] 100mL 容量瓶。
[0088] 250ml 容量瓶。
[0089] 40ml带盖螺盖玻璃管。
[0090] 1000 ul 移液器。
[0091] 5000ul 移液器。
[0092] 15mL塑料离心管。
[0093] 测定步骤：
[0094] 样品处理
[0095] (1)称取0· 1000克样品至于40ml玻璃管内。（每个待测样品重复取样至少两组。）
[0096] (2)加水15ml (溶解体积，V)，漩涡震荡3次，每次lmin，每次间隔20min。
[0097] (3)震荡后超声20min。再次漩涡震荡。
[0098] (4)从玻璃管内取试液3ml至5ml离心管内。12000g高速离心15min。
[0099] (5)取上清液2ml至5ml离心管内，加水2ml，稀释一倍。混匀后保存过滤上机测 定。
[0100] 用高效液相色谱法对样品进行测定，采用以下色谱条件：
[0102](注：分析结束后使用100%乙腈溶液清洗色谱柱后储存）
[0103] 洗脱程序如下表1 :
[0104] 表 1
[0106] 如图1及图2所示，上述步骤能将这几种游离的核苷酸、核酸及碱基很好的分离。
[0107] 结果计算
[0108] 使用外标法测定出样品中游离碱基、核苷酸的含量。
[0109] 试样中碱基、核苷、核苷酸含量ω,以质量分数标识，数值以％表示，按公式计算：
[0112] 式中：
[0113] A一一样品核苷酸、碱基的色谱峰面积
[0114] Ast一一标准品的色谱峰面积
[0115] Cst 标准品的浓度
[0116] X--某一核苷酸、或核苷，或碱基
[0117] C--核苷酸浓度ug/ml ;
[0118] V--溶解体积ml;
[0119] m--样品重量（g);
[0120] ωχ--含量 ％ ；
[0121] 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留2位有效数字。
[0122] 精密度
[0123] 重复以上检测，使获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%〇
[0124] 使用上述测定方法测得的自溶工艺产品的游离核苷酸及游离碱基的含量见下表， 表中可以看出产品在自溶后可以产生较高含量的核苷酸，且要高于市售的酵母产品。
[0126] 实施例2 :自溶生产工艺及产品
[0127] 本发明开发的自溶生产工艺及产品是利用发明专利W02009059163A1的培养技术 制成的单细胞蛋白产品，但不限于此，也适用于与该发明类似的好氧型单细胞蛋白产品的 加工，具体包含以下操作步骤：
[0128] 1)沉淀浓缩：定期将生物反应器产生的菌体蛋白通过管道排入沉淀浓缩池，菌体 蛋白在锥形的浓缩池底部沉淀，底部物料含水率降低至98%以下，可进行后续脱水工序。
[0129] a)本实施例中的池体直径：15米，深度：3. 5米，有效容积：477立方米。
[0130] 2)自溶：使用抽料栗将浓缩池底部物料输送至自溶设备。
[0131] a)本实施例自溶设备是立式酶解反应罐。设备参数：容积为5000升，换热面积为 13. 5平方米，搅拌功率为4. 0千瓦，搅拌桨叶形式为框式，夹套加热使用饱和蒸汽。
[0132] b)本实施例自溶的温度要求为：升温后的物料温度保持在65°C~95°C，优选的自 溶温度为65°C~80°C，进一步优选的自溶温度为70°C。
[0133] c)所述自溶的时间要求为：物料栗入酶解罐后的加热阶段升值目标温度的时间 应小于30分钟，优选的应小于20分钟。保温阶段的自溶时间应在90分钟。
[0134] 上述最适自溶温度范围通过梯度试验获得，试验参数为：菌体蛋白的蛋白含量 35. 00%，自溶设备为恒温水浴锅，物料含水率为82%，自溶时间共120分钟，自溶温度见下 表梯度范围，自溶后物料经微波灭菌、烘干后_20°C冰箱保存备测。
[0135] 从下表3可以看出，自溶温度高于65 °C时，在60分钟内即可自溶产生较高含量的 游离核苷酸，在60分钟内65°C~70°C时产生游离核苷酸含量较高，120分钟时仍以70°C条 件产生的游离核苷酸含量最高。
[0136] 表 3
[0137] CN 105176850 A 说明书 9/12 页
[0138] 从下表4可以看出，65°C以上自溶时，60分钟可产生较低含量的游离碱基，说明腐 败微生物没有大规模生长。在60°C时产生的游离含量最高，同时游离核苷酸含量也不高，说 明此温度下产生的游离核苷酸被腐败微生物利用，从而降低了自溶的效果。
[0139] 表 4
[0141] 从下表5及图4的时间梯度试验数据可以看出，在60°C自溶时会持续产生碱基，说 明腐败微生物会持续生长，在180分钟~240分钟时游离碱基含量超过了游离核苷酸的含 量，气味上已经出现腐臭的味道，说明此温度自溶作用差，主要发生了腐败变质。
[0142] 表 5
[0144] 从上述试验数据看出，合适的自溶温度对于产品的质量有较大的影响。
[0145] 3)干燥：自溶后的物料通过输送栗输送至干燥设备进行干燥。
[0146] a)所述干燥设备可为喷雾干燥设备。
[0147] b)所述干燥后的物料的含水率为10~20%
[0148] 4)灭菌：经干燥后的物料通过气流提升设备输送至隧道式微波干燥灭菌设备进 行灭菌。
[0149] c)所述微波灭菌后的物料的霉菌总数、细菌总数符合〈GB 13078-2001饲料卫生 标准〉。
[0150] d)所述微波灭菌后物料含水率为5%~10%。
[0151] 5)粉碎包装：灭菌后的物料经粉碎后包装成成品。
[0152] 经上述生产工艺制成的单细胞蛋白应同时具有以下质量指标：
[0153] a)单位蛋白的游离核苷酸含量应高于1. 40%
[0154] b)单位蛋白的游离碱基含量应低于0. 90%
[0155] c)游离碱基与游离核苷酸的比值应在0~0. 60范围内。
[0156] 蛋白含量为40%的菌体蛋白经过上述加工方法的加工后所获得的产品的关键指 标见表6。
[0157] 表 6
[0159] 实施例3:消化率试验
[0160] 通过动物试验评估了使用自溶工艺的菌体蛋白与普通菌体蛋白在表观消化率上 的差异。
[0161] 消化率是动物所摄取的饲料成分中，可消化养分占食入饲料养分的百分率。指示 剂法就是用饲料中存在的或人工均匀掺入的指示剂。饲喂鱼后从单位饲料和粪中所含单位 指示剂的量求算消化率。以饲料原料营养素的可消化值为依据进行配方编制，对于提高配 合饲料的消化利用率、减少饲料物质对养殖水环境的