一株产α-L-鼠李糖苷酶的菌株及采用该菌株发酵生产α-L-鼠李糖苷酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株产α-L-鼠李糖苷酶的菌株，及采用该菌株发酵生产α-L-鼠李糖苷酶的方法，具体涉及一种互隔交链孢(Al ternaria al terna ta ) SK37.002生产a -L-鼠李糖苷酶的方法，属于食品生物技术领域。
【背景技术】
[0002]a -L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是一种水解酶，它能够水解结合于底物末端非还原性的a -L-鼠李糖苷键，同时释放出鼠李糖和相应的配基。a -L-鼠李糖苷酶的来源比较广，广泛分布于自然界的细菌和真菌、动物肝脏中，另外a-L-鼠李糖苷酶是植物细胞壁果胶多糖、糖蛋白以及二级代谢物如花青苷、类黄酮和三萜烯类等化合物的一种组分，也常存在于细菌杂多糖、鼠李糖脂和细菌外膜脂多糖抗原结构的重复单位中。
[0003]a -L-鼠李糖苷酶在食品中的应用主要是改善饮料和酒的香气成分和生产食品添加剂。很多水果都含有柚皮苷、橘皮苷、云香苷和萜烯基糖苷等黄酮苷类化合物。a-L-鼠李糖苷酶可以水解芸香科水果中的柚皮苷和柠檬苦素以去除果汁中的苦味，从而使果汁酸甜可口，口味宜人。a -L-鼠李糖苷酶还可以提高黄酮类化合物的生物利用度，可用于生产功能饮料。a -L-鼠李糖苷酶可以水解橘皮苷生产甜味剂的前体物，使食品获得新的高聚物成分从而改善食品的流变特性，因而在食品添加剂中具有重要作用。
[0004]迄今为止，由于菌种、发酵条件等限制，a -L-鼠李糖苷酶仍未大规模生产，因此纯酶价格昂贵，限制了该酶的应用发展。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株产a -L-鼠李糖苷酶的菌株及采用该菌株发酵生产a -L-鼠李糖苷酶的方法。
[0006]本发明的技术方案:一株产a -L-鼠李糖苷酶的菌株，其分类命名为互隔交链孢{Al ternaria al terna ta ) SK 37.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015 年 5 月 17 日，保藏编号为 CCTCC NO:M 2015309。
[0007]所述产a-L-鼠李糖苷酶的菌株，该菌株的核糖体DNA ITS序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]用所述产a -L-鼠李糖苷酶的菌株发酵生产a -L-鼠李糖苷酶的方法，步骤为:以柚皮苷和鹿糖为碳源的发酵培养基中对互隔交链孢(WJferaaria alternata),CCXCC NO:M2015309进行发酵，以得到含有a -L-鼠李糖苷酶的菌体；然后对含a -L-鼠李糖苷酶的菌体进行破碎，最后对a -L-鼠李糖苷酶进行分离纯化。
[0009]具体步骤为:
(l)a-L-鼠李糖苷酶的制备:对互隔交链孢CCTCC NO:M 2015309，进行斜面、种子、发酵三级培养生产，培养基各组分以g/L计: a、斜面培养:采用PDA培养基:马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15~20，pH自然，使用去离子水配制，115°C灭菌30min ;斜面培养条件为:培养温度25~35°C，培养时间3~8天；
b、种子培养:种子培养基=NaNO32，K2HPO4 LKCl 0.5，MgSO4 0.5，FeSO4 0.1，蔗糖 30，pH自然，使用去离子水配制，121°C灭菌20 min ;种子培养条件:于30°C、200rpm摇床培养12h ；
c、发酵培养:发酵培养基:柚皮苷1，蔗糖5，硝酸钠5，磷酸氢二钾0.8，氯化钙0.7，氯化钾0.5，硫酸镁0.5，FeSO4 0.1，自然pH ;使用去离子水配制，121°C灭菌20 min ;发酵条件:接种量5%、转速200rpm、温度30°C的条件下在发酵培养基中发酵4_5d，得到a -L-鼠李糖苷酶菌体；
(2)a -L-鼠李糖苷酶的纯化:对步骤(I)所得a -L-鼠李糖苷酶菌体进行菌体过滤、洗涤，在缓冲液中溶解后采用1cm探头超声破碎10min，10000r/min离心lOmin，采用20%~70%硫酸铵分离沉淀目的蛋白，缓冲液透析，DEAE-FF 16/10离子交换层析，Superdex75凝胶过滤层析后，最后将得到的液体冷冻干燥即得a -L-鼠李糖苷酶。
[0010]本发明中的a -L-鼠李糖苷酶，是通过使酶作用于柚皮苷，分解柚皮苷的消耗量。该酶的单位定义为在酶反应条件下每分钟消耗I μ g柚皮苷的量。
[0011]本发明的有益效果:本发明为首次报道互隔交链孢(Wteraaria al terna ta )作为a -L-鼠李糖苷酶的产生菌。该菌株培养方便；发酵工艺简单；酶活高，酶性质稳定；具有广阔的市场应用前景。
[0012]生物材料样品保藏:一株产a -L-鼠李糖苷酶的菌株，其分类命名为互隔交链孢(Al ternaria al terna ta ) SK 37.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址:中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015309，保藏日期2015年5月17日。
【具体实施方式】
[0013]以下是互隔交链孢(Wteraaria al terna ta ) SK 37.002进行发酵产a-L-鼠李糖苷酶的实施例，但本发明的技术范围并不限于所列出的几个实例，在不改变其要点的前提下，可做各种改变进行实施。另外，本发明的技术范围延及均等的范围。
[0014]实施例1
将互隔交链孢al terna ta ) SK 37.002在下述条件下进行发酵:
斜面培养:采用PDA培养基(各组分以g/L计):马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15~20，pH自然，使用去离子水配制，115°C灭菌30min。培养条件为:培养温度25~35°C，培养时间3~8天;
种子培养:采用种子培养基(各组分以g/L计)=NaNO3 2, K2HPO4 LKCl 0.5, MgSO4 0.5，FeSO4 0.1，蔗糖30，pH自然，使用去离子水配制，121°C灭菌20 min ;种子培养条件:于30°C、200rpm 摇床培养 12h ；
发酵培养:采用发酵培养基(各组分以g/L计):柚皮苷1，蔗糖5，硝酸钠5，磷酸氢二钾0.8，氯化钙0.7，氯化钾0.5，硫酸镁0.5，FeSO4 0.1，自然pH ;使用去离子水配制，121°C灭菌20 min ;发酵条件:接种量5%，转速200rpm、温度30°C的条件下在发酵培养基中发酵4-5d，得到含a -L-鼠李糖苷酶的菌体；
实施例2 a -L-鼠李糖苷酶酶粉制备: 将实施例1所得含a -L-鼠李糖苷酶的菌体过滤、洗涤，在缓冲液中溶解后采用1cm探头超声破碎lOmin，10000r/min离心lOmin，采用20%~70%硫酸钱分离沉淀目的蛋白，缓冲液透析，DEAE-FF 16/10离子交换层析，Superdex 75凝胶过滤层析后，最后将得到的液体冷冻干燥即得a -L-鼠李糖苷酶。
【主权项】
1.一株产a -L-鼠李糖苷酶的菌株，其分类命名为互隔交链孢(AJ ternariaalternata ) SK 37.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015309。2.根据权利要求1所述产a-L-鼠李糖苷酶的菌株，其特征在于该菌株的核糖体DNAITS序列如SEQ ID N0.1所示。3.用权利要求1或2所述产a-L-鼠李糖苷酶的菌株发酵生产a -L-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于步骤为:以柚皮苷和蔗糖为碳源的发酵培养基中对互隔交链孢CCTCC NO:Μ2015309进行发酵，以得到含有a -L-鼠李糖苷酶的菌体；然后对含a -L-鼠李糖苷酶的菌体进行破碎，最后对a -L-鼠李糖苷酶进行分离纯化。4.根据权利要求3所述用产a-L-鼠李糖苷酶的菌株发酵生产a -L-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于具体步骤为: (1)α-L-鼠李糖苷酶的制备:对互隔交链孢CCTCC NO:Μ 2015309，进行斜面、种子、发酵三级培养生产，培养基各组分以g/L计: a、斜面培养:采用PDA培养基:马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15~20，pH自然，使用去离子水配制，115°C灭菌30min ;斜面培养条件为:培养温度25~35°C，培养时间3~8天； b、种子培养:种子培养基=NaNO32，K2HPO4 LKCl 0.5，MgSO4 0.5，FeSO4 0.1，蔗糖 30，pH自然，使用去离子水配制，121°C灭菌20 min ;种子培养条件:于30°C、200rpm摇床培养12h ； C、发酵培养:发酵培养基:柚皮苷1，蔗糖5，NaNO3 5，K2HPO4 0.8，CaCl 0.7，KCl 0.5，MgSO4 0.5，FeSO4 0.1，自然pH ;使用去离子水配制，121°C灭菌20 min ;发酵条件:接种量5%、转速200rpm、温度30°C的条件下在发酵培养基中发酵4-5d，得到含a -L-鼠李糖苷酶的菌体； (2)a -L-鼠李糖苷酶的纯化:对步骤(I)所得含a -L-鼠李糖苷酶的菌体进行菌体过滤、洗涤，在缓冲液中溶解后采用1cm探头超声破碎10min，10000r/min离心lOmin，20%~70%硫酸铵分离沉淀目的蛋白，缓冲液透析，DEAE-FF 16/10离子交换层析，Superdex75凝胶过滤层析后，最后将得到的液体冷冻干燥即得a -L-鼠李糖苷酶。
【专利摘要】一株产α-L-鼠李糖苷酶的菌株及采用该菌株发酵生产α-L-鼠李糖苷酶的方法，属于食品生物技术领域。本发明公开一株产α-L-鼠李糖苷酶的菌株，其分类命名为互隔交链孢（<i>Alternaria</i><i>？alternata</i>？）SK？37.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO：M？2015309。本发明以蔗糖、柚皮苷为碳源的发酵培养基对互隔交链孢（<i>Alternaria</i><i>？alternata</i>？）SK37.002，即CCTCC？NO：M？2015309进行发酵，得到含有α-L-鼠李糖苷酶的菌体；然后对菌体进行破碎和α-L-鼠李糖苷酶进行分离纯化。本发明生产的α-L-鼠李糖苷酶安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，被广泛地应用于食品、医药、生物等行业。本发明能高效地生产α-L-鼠李糖苷酶，适于进行大规模生产。CCTCC NO：M 201530920150517
【IPC分类】C12N1/14, C12R1/645, C12N9/24
【公开号】CN105176843
【申请号】
【发明人】张涛, 江波, 袁文博, 沐万孟, 缪铭
【申请人】江南大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月22日