一种具有抗氧化活性的人参蛋白及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的人参 蛋白制备方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 人参，属五加科人参属，为多年生宿根草本植物，是国内外公认的药用保健珍品， 被誉为"百草之王"。作为一味名贵药材，人参在历史悠久的中医学中，有着自己举足轻重的 地位。人参中含有多种功效成分，包括人参皂苷、酚酸、多糖、蛋白质、挥发油等。研究表明， 人参蛋白具有良好的抗氧化、调节血糖、血脂、抗衰老、提高免疫力的作用。我们在前期研究 工作中发现，人参蛋白不但能够提高正常小鼠体内SOD和MDA含量，而且可以提高辐射小鼠 体内SOD和MDA含量，具有一定的清除自由基和抗氧化作用，且以对受损机体产生的过量自 由基清除效果较明显，可见人参蛋白具有较好的抗氧化作用。近些年，随着人们健康、保健 意识的提高，中药保健品及食品市场正在迅速发展。到目前为止，全球中药保健品及食品的 销售已超过1000亿美元，并还在以平均每年增长率为百分之二。因此中药保健品及食品存 在着巨大的市场开发潜力。而由于社会和科技的发展使得人们的生活节奏越来越快，工作、 学习和生活的压力也越来越快，同时吸烟、不良化妆品、环境污染等外源性因素，进而引起 人体内过量自由基蓄积，超出人体自身的自由基清除能力，引发衰老、肿瘤、心脑血管、老年 性痴呆等疾病。因此，针对于中老年人群，生活节奏快、工作压力大的上班族，学业繁重的学 生族及更年期的妇女，开发具有抗氧化功效的保健食品及食品，保持他们的良好精神状态， 提高其身体各器官机能，缓解亚健康状态，具有十分广阔的市场前景。
[0004] 在传统人参加工方式中，人参蛋白一直是被忽略乃至摒弃的成分。因此，一直以来 均缺乏适合于工业化生产的人参蛋白大规模制备技术，具有抗氧化活性的人参蛋白制备技 术未见报道。现有对植物蛋白提取的方法，主要包括硫酸铵沉淀法、有机试剂提取法、膜过 滤法等。硫酸铵沉淀法是最常见的蛋白质提取方法，但它周期长，操作繁琐，需要透析除盐， 并且长时间透析对蛋白质构象和活性会产生很多不利影响，不适合大规模生产；有机试剂 提取法所用试剂包括丙酮、三氯乙酸等，易引起蛋白质变性，有机试剂成本高、不易去除、安 全性差，同样不适合食品和保健品的生产。超滤技术，不需要透析，无毒，生产周期短，提取 蛋白质纯度高、活性好，十分适合大规模生产富集高活性中药蛋白质。凝胶层析所选用的载 体为惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作简单，条件温和，无需有机溶剂且不影响样品的理 化性质。本发明利用超滤技术及凝胶层析建立人参蛋白的制备方法，制备的人参蛋白具有 较好的抗氧化活性，并且制备方法简便，适用于工业生产，可用于保健食品及食品开发。
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供了一种具有抗氧化活性的人参蛋白制备方法，其制备步骤如 下： (1)、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:3-1:8的比例加入pH值为7-8的0.0 lmol/ L Tris-HCl缓冲液或蒸馏水搅拌均匀后，置于O-KTC环境下每次浸提3-10小时，浸提2-4 次，合并浸提后的上清液，即得人参蛋白粗提液。
[0007] (2)、上述制备的人参蛋白粗提液经过0.22-0. 45iim滤膜过滤澄清后，将其置于 截留分子量为5-30KDa的超滤膜装置进行超滤，分离去除小分子化合物。
[0008] (3)将超滤浓缩后的浸提液用Sephadex_G75凝胶层析，层析柱规格为16*200mm， 上样量为柱体积的5%-20%，流速0. 5-1. Ocm/min，在280nm紫外吸收下检测出峰并收集、冻 干，即得人参蛋白。
[0009]
【附图说明】
[0010] 附图为本发明实施例1-4中制备的人参蛋白SDS-PAGE图谱。
[0011] 其中：1.蛋白marker、2.实施例1图谱、3.实施例2图谱、4.实施例3图谱、5.实 施例4图谱。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 (1)、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:8的比例加入pH值为7的0.01m〇l/L Tris-HCl缓冲液搅拌均匀后，置于4°C环境下浸提4小时，浸提2次，合并浸提后的上清液， 即得人参蛋白粗提液。
[0013] (2)、上述制备的人参蛋白粗提液经过0.22-0. 45ixm滤膜过滤澄清后，将其置于 截留分子量为5-30KDa的超滤膜装置进行超滤，分离杂质及皂苷的小分子化合物。
[0014] (3)将超滤浓缩后的浸提液用Sephadex_G75凝胶层析，层析柱规格为16*200mm， 上样量为柱体积的5%，流速1.0 cm/min，在280nm紫外吸收下检测出峰并收集、冻干，即得人 参蛋白。
[0015] (4)、称取所得样品的质量，计算提取率；采用考马斯亮蓝方法检测蛋白纯度， SDS-PAGE蛋白电泳获得蛋白图谱。
[0016] 实施例2 (1)、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:8的比例加入蒸馏水搅拌均匀后，置于4°C环 境下每次浸提8小时，浸提2次，合并浸提后的上清液，即得人参蛋白粗提液。
[0017] (2)、上述制备的人参蛋白粗提液经过0.22-0. 45ixm滤膜过滤澄清后，将其置于 截留分子量为5-30KDa的超滤膜装置进行超滤，分离杂质及皂苷的小分子化合物。
[0018] (3)将超滤浓缩后的浸提液用Sephadex_G75凝胶层析，层析柱规格为16*200mm， 上样量为柱体积的10%，流速I. 〇cm/min，在280nm紫外吸收下检测出峰并收集、冻干，即得 人参蛋白。
[0019] (4)、称取所得样品的质量，计算提取率；采用考马斯亮蓝方法检测蛋白纯度， SDS-PAGE蛋白电泳获得蛋白图谱。
[0020] 实施例3 (1)、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:8的比例加入蒸馏水搅拌均匀后，置于4°C环 境下浸提8小时，再按着1:4的比例加入蒸馏浸提1次，合并浸提后的上清液，即得人参蛋 白粗提液。
[0021] (2)、上述制备的人参蛋白粗提液经过0.22-0. 45 ixm滤膜过滤澄清后，将其置于 截留分子量为5-30KDa的超滤膜装置进行超滤，分离杂质及皂苷的小分子化合物。
[0022] (3)将超滤浓缩后的浸提液用Sephadex_G75凝胶层析，层析柱规格为16*200mm， 上样量为柱体积的15%，流速0. 5cm/min，在280nm紫外吸收下检测出峰并收集、冻干，即得 人参蛋白。
[0023] (4)、称取所得样品的质量，计算提取率；采用考马斯亮蓝方法检测蛋白纯度， SDS-PAGE蛋白电泳获得蛋白图谱。
[0024] 实施例4 (1)、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:8的比例加入蒸馏水搅拌均匀后，置于4°C环 境下浸提8小时，再按着1:4的比例加入蒸馏浸提2次，合并浸提后的上清液，即得人参蛋 白粗提液。
[0025] (2)、上述制备的人参蛋白粗提液经过0.22-0. 45 ixm滤膜过滤澄清后，将其置于 截留分子量为5-30KDa的超滤膜装置进行超滤，分离杂质及皂苷的小分子化合物。
[0026] (3)将超滤浓缩后的浸提液用Sephadex_G75凝胶层析，层析柱规格为16*200mm， 上样量为柱体积的20%，流速0. 5cm/min，在280nm紫外吸收下检测出峰并收集、冻干，即得 人参蛋白。
[0027] (4)、称取所得样品的质量，计算提取率；采用考马斯亮蓝方法检测蛋白纯度， SDS-PAGE蛋白电泳获得蛋白图谱。
[0028] 实例1-4制备的人参蛋白样品，蛋白纯度及蛋白回收率比较，如下表1所示。
[0029] 表1人参蛋白的蛋白纯度和回收率
本发明制备的人参蛋白具有较好的抗氧化酶活性，如下表2所示。
[0030] 表2人参蛋白的抗氧化酶活性
本发明制备的人参蛋白抗氧化动物实验 1、动物分组 取昆明小鼠40只，雌雄各半，随机分为对照组（2 mL/kg蒸馏水)和人参蛋白组(高剂量 1.0 g/kg、中剂量0. 5 g/kg、低剂量0. 25 g/kg)，每组10只，灌胃给药，每天一次，连续30 d〇
[0031] 2、SOD、MDA含量测定 小鼠颈椎脱白处死后，立即眼球取血并剥取肝脏。全血经生理盐水冲洗，冷双蒸水混 合、95%乙醇振荡、三氯甲烷抽提制备SOD抽提液，按照试剂盒说明书测定SOD活力。肝组织 经生理盐水冲洗，磷酸盐缓冲液匀浆制成5%组织匀浆液，取上清按照试剂盒说明测定MDA 含量。
[0032] 3、实验结果： 按照试剂盒方法分别测定红细胞SOD活性及肝脏MDA含量，并按照试剂盒所示公式进 行计算，结果见表3。
[0033] 人参蛋白组与对照组比较，SOD活性明显升高，且成一定量效关系，说明人参蛋白 可对抗辐射所致SOD活性降低；MDA含量增高，成一定量效关系，说明人参蛋白可能具有抑 制小鼠MDA含量升高的的作用。
[0034] 这说明人参蛋白具有一定的清除自由基和抗氧化作用。
[0035] 表3人参蛋白对小鼠S0D、MDA含量影响（n=10,土s)
注：与对照组比较，*P〈〇. 05, #P〈0. 01。
【主权项】
1. 一种具有抗氧化活性的人参蛋白制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤： (1) 、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:3-1:8的比例加入pH值为7-8的Tris-HCl 缓冲液或蒸馏水搅拌均匀后，置于〇-l〇°C环境下每次浸提3-10小时，浸提2-4次，合并浸提 后的上清液，即得人参蛋白粗提液； (2) 、上述制备的人参总蛋白粗提液经过0.22-0. 45ym滤膜过滤澄清后，将其置于截 留分子量为5-30KDa的超滤膜装置进行超滤浓缩，并分离去除小分子化合物； (3) 将超滤浓缩后的浸提液用Sephadex-G75凝胶层析，层析柱规格为16*200mm，上样 量为柱体积的5%-20%，流速0. 5-1.Ocm/min，在280nm紫外吸收下检测出峰并收集、冻干，BP 得人参蛋白。2. 按权利要求1中所述的方法制备的人参蛋白。3. 按权利要求1中所述的方法制备的人参蛋白用于提高体内超氧化物歧化酶SOD和过 氧化物酶MDA含量，清除自由基和抗氧化。4. 按权利要求1中所述的方法制备的人参蛋白用于制作保健食品。
【专利摘要】本发明属于植物蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的人参蛋白制备方法。本发明利用超滤技术及凝胶层析建立人参蛋白的制备方法，制备的人参蛋白具有较好的抗氧化活性，并且制备方法简便，适用于工业生产，可用于保健食品及食品开发。
【IPC分类】C07K1/34, C07K1/36, C07K1/16
【公开号】CN105175487
【申请号】
【发明人】孙立伟, 姜锐, 麻锐, 冯凯, 刘建增, 徐晓浩
【申请人】北华大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月11日