一种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗。
【背景技术】
[0002] 刚地弓形虫（goWii)是一种严格胞内寄生性原虫，呈世界性分布，能 感染包括人和动物在内的所有温血动物，是典型的人兽共患性寄生虫病病原。全球约有35% 的人群感染弓形虫，部分地区感染率更高。弓形虫感染多呈隐性，对免疫功能低下或缺陷病 人如器官移植病人、AIDS和恶性肿瘤患者以及孕妇人群危害最大。同时，弓形虫感染家畜， 能够造成患病家畜流产、早产、死胎、畸胎等症状，给畜牧业发展带来巨大经济损失。目前仍 无治疗弓形虫病的理想药物，因此研制安全有效的抗弓形虫疫苗在弓形虫病的预防和治疗 中尤为重要。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗，具有良好的免疫效果。
[0004]丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞信号转导途径的重要组分，有丝氨酸/苏氨酸 激酶活性，主要介导DNA损伤修复以及细胞增殖、分化、凋亡、迀移和应激反应等重要生命 活动，与炎症和肿瘤的发生发展紧密相关。弓形虫er々7基因编码的ERK7蛋白属MAPK激酶 家族，可能参与调控机体细胞的增殖和/或分化功能。弓形虫基因由11个外显子和 10个内含子组成，全长6596bp，负责编码692个氨基酸，分子量约74kD。本发明将弓形 虫e>r々7基因原核表达所得的ERK7蛋白与弗氏佐剂（Freund'sadjuvant，FA)联合应用，进 行抗弓形虫急性和/或慢性感染的免疫效果评估。结果显示，该蛋白疫苗的免疫新方案能 够有效地延长弓形虫GT1急性感染BALB/c鼠的存活时间，以及抑制弓形虫PRU慢性感染中 脑包囊的产生，取得了较好的免疫保护性效果。
[0005]本发明提供一种一种免疫原性组合物，所述组合物由弓形虫重组蛋白和佐 剂。
[0006]作为优选方案，所述佐剂为弗式完全佐剂和弗氏不完全佐剂。
[0007] 作为另一优选方案，所述疫苗中的蛋白浓度为0. 7mg/mL。
[0008] 作为又一优选方案，所述弓形虫重组蛋白与佐剂的体积比值为：1:1。
[0009]本发明还要求保护一种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗，所述疫苗的有效成分为 权利要求1-4任一所述的免疫原性组合物。
[0010] 本发明还要求保护疫苗的制备方法，步骤如下： (1) 制备弓形虫er々7重组蛋白； (2) 将弓形虫重组蛋白与佐剂混合制剂，得到疫苗。
[0011] 本发明还要求保护上述免疫原性组合物或免疫疫苗在制备预防弓形虫感染的药 物中的应用。
[0012] 本发明还要求保护编码权利要求1所述的弓形虫重组蛋白的核酸。
[0013] 本发明还要求保护包含权利要求7所述核酸的表达载体。
[0014] 本发明还要求保护包含权利要求8所述的表达载体的宿主细胞。
[0015] 本发明的免疫疫苗能够有效地延长弓形虫GT1急性感染BALB/c鼠的存活时间，本 发明的免疫疫苗对PRU急性感染并无明显效果，但能大幅度降低弓形虫PRU慢性感染中脑 包囊数目，取得了良好的免疫效果。
【附图说明】
[0016] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为弓形虫GT1感染BALB/c鼠存活时间线形图； 图2为弓形虫PRU慢性感染中脑包囊数目线形图； 图3为原核表达载体pET30a质粒图； 图4为重组载体pET30a-er々7质粒图。
【具体实施方式】
[0017] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0018] 实施例1 (一）构建原核表达载体pET30a-er々7 1、弓形虫GT1总RNA的提取：从液氮中取出弓形虫GT1虫株，37 °C迅速解冻后腹腔接 种BALB/c雌鼠若干。连续传代三次后，无菌收集发病的BALB/c鼠腹水，室温9000rpm离 心10min。沉淀用于GT1总RNA提取，提取方法参照北京天根生化科技有限公司RNAprep Pure动物组织总RNA提取试剂盒的使用说明书进行。
[0019] 2、弓形虫基因的特异性扩增：以弓形虫GT1总RNA为模板，参照 PrimeScript?OneStepRT-PCR试剂盒（TaKaRa)使用说明，特异性扩增er々7目的基因，反 应体系为：PrimeScript?OneStepEnzymeMixlyL，2XOneStepBuffer12.5yL，上 / 下游引物（20yM)各0.5yL，总RNA模板lyL，补加RNaseFreedH20至25.0yL;反应条 件为：50°CRT反应 30min;95°CRTase失活 2min;95 °C预变性 5min;95 °C变性 45 s，56. 5 °C退火30s，72 °C延伸2min，共进行35个循环；最后72 °C延伸10min。
[0020] 上游引物：5,-GGAATTCCATATGAAACACCATCATCATCATCATCAGATGAGTGACGAGGTCGACA AAC-3，， 下游引物：5'-CCGGAATTCTTATCAGCTGTTGTATGTCTTGGAC-3'。
[0021] 其中，单划线、双划线和虚线标注处分别为AWel位点、6XHis标签和AcoRI位点； 3、目的基因的连接、转化与测序：RT-PCR产物经回收纯化后与pMD18-TVector (TaKaRa)4 °C条件下连接过夜，产物命名为pMD18-er々7,并将其转入DH5a感受态细胞。阳 性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果显示，扩增的的核苷酸序列 参见序列表SEQID No. 1，其编码的氨基酸序列参见序列表SEQID No. 2。
[0022] 4、小量提取质粒：参照北京天根生化科技有限公司TIANprepMiniPlasmidKit 的使用说明进行。
[0023] 5、目的片段的回收与原核表达载体的构建：将pET30a和pMD18-er々7质粒分别双 酶切（yWelA5boRI)后，进行目的片段的回收纯化。经T4DNALigase(TaKaRa)，将er々7基 因定向亚克隆至pET30a原核表达载体中。连接产物转入原核表达菌BL21的感受态细胞中， 阳性菌株命名为pET30a-er々7。其核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.4。
[0024](二）ERK7原核表达蛋白的纯化与定量 1、原核表达ERK7蛋白：将阳性表达菌pET30a-er々7 0. 4mL接种于400mLLB培养基 (Kan+抗性）中，培养过夜后常规诱导ERK7蛋白的表达。
[0025] 2、ERK7蛋白的预处理：4°C条件下，9000rpm离心10min，弃上清。向所得菌体沉 淀中加入20mL无菌PBS溶液，漩涡震荡混匀。-80 °C与37 °C反复冻融三次后进行超声破 碎(超声4s，停3s，共超声破碎7min)。超声结束后，4°C10000rpm离心1min，弃上 清，沉淀用40mL8M尿素溶解。
[0026] 3、ERK7蛋白的纯化：蛋白纯化参照Novagen公司Ni-NTAHis?Bind?Resin试剂 盒使用说明进行。
[0027] 4、ERK7蛋白的透析：使用21MM透析袋(MW:12000-14000)常规透析，透析液为无 菌PBS溶液。
[0028] 5、ERK7蛋白的定量：透析产物的浓度用分光光度计在280nm波长处测得，浓度为 1.238mg/mL。
[0029](三）免疫效果的评估 1、BALB/c实验鼠的分组：4-6周龄BALB/c雌鼠购买自中国农业科学院兰州兽医研究所 实验动物中心，并将其随机分为3组（I:BlankControl;II:PBS+FA;III:ERK7+FA)，每组 16只。
[0030] 2、免疫方案： 第I组（BlankControl):不作任何处理，为空白对照组； 第II组（PBS+FA):无菌PBS溶液与FA等体积混合，完全乳化(连续震荡混匀1. 5h，下 同）后，经两个途径(腿部肌肉注射和颈部皮下接种，下同）免疫BALB/c鼠； 第III组（ERK7+FA) :70yg步骤(二）得到的ERK7蛋白与100yLFA等体积混合， 经完全乳化后免疫BALB/c鼠； 免疫时间间隔为1 ?，共免疫5次，其中前2次所用佐剂为弗氏完全佐剂，后3次为弗氏 不完全佐剂。每只BALB/c鼠每次每部位免疫100yLPBS+FA或100yLERK7+FA。
[0031] 3、弓形虫GT1和PRU虫株的攻击感染：最后一次免疫（即第5次免疫)后的第14d 进行攻虫感染实验，具体攻虫方案如下所示： 腹腔注射弓形虫GT1株：将新鲜收集的弓形虫GT1速殖子稀释为10 4个/mL后，按照 每只100yL的注射剂量，腹腔感染BALB/c鼠(每组8只），观察并记录实验鼠存活时间。 结果显示，本发明的蛋白疫苗能够有效地延长弓形虫GT1急性感染BALB/c鼠的存活时间 (代〇. 05)，具体结果见表1和图1A: 表1弓形虫GT1感染BALB/c鼠存活时间统计表
*KO. 05 灌胃感染弓形虫PRU株：将新鲜收集的弓形虫PRU包囊稀释为200个/mL后，按照每只 100yL的灌胃剂量，经口感染BALB/c鼠(每组8只），观察并记录实验鼠存活时间。灌胃感 染28d后处死存活小鼠，进行脑包囊计数。结果显示，本发明的蛋白疫苗对PRU急性感染 并无明显效果，但能大幅度降低弓形虫PRU慢性感染中脑包囊数目（K0. 001)，具体结果见 表2,表3和图1B，图2所示： 表2弓形虫PRU感染BALB/c鼠存活时间统计表
表3弓形虫PRU感染BALB/c存活鼠脑包囊计数统计表
林* K0. 001〇
[0032]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种免疫原性组合物，其特征在于：所述组合物由弓形虫重组蛋白和佐剂。2. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于：所述佐剂为弗式完全佐剂和 弗氏不完全佐剂。3. 根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于：所述疫苗中的蛋白浓度 为 0? 7mg/mL〇4. 根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于：所述弓形虫重组蛋 白与佐剂的体积比值为：1:1。5. -种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗，其特征在于：所述疫苗的有效成分为权利要 求1-4任一所述的免疫原性组合物。6. 权利要求5所述的疫苗的制备方法，其特征在于：步骤如下： (1) 制备弓形虫er々7重组蛋白； (2) 将弓形虫重组蛋白与佐剂混合制剂，得到疫苗。7. 权利要求1-4任一所述的免疫原性组合物或权利要求5所述的免疫疫苗在制备预防 弓形虫感染的药物中的应用。8. 编码权利要求1所述的弓形虫重组蛋白的核酸。9. 包含权利要求8所述核酸的表达载体。10. 包含权利要求9所述的表达载体的宿主细胞。
【专利摘要】本发明提供一种免疫原性组合物，所述组合物由弓形虫<i>erk</i>7重组蛋白和佐剂。本发明还提供用于弓形虫感染预防的免疫疫苗，所述疫苗的有效成分为权利要求1-4任一所述的免疫原性组合物。本发明的免疫疫苗能够有效地延长弓形虫GT1急性感染BALB/c鼠的存活时间，本发明的免疫疫苗对PRU急性感染并无明显效果，但能大幅度降低弓形虫PRU慢性感染中脑包囊数目，取得了良好的免疫效果。
【IPC分类】A61K39/39, C12N15/12, A61K39/002, A61P33/02, C12R1/19, C12N1/21, C12N15/70
【公开号】CN105169387
【申请号】
【发明人】李中原, 赵禹, 朱兴全, 徐民俊
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月31日