茯苓多糖的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物提取技术领域，具体涉及茯苓多糖的提取方法。
【背景技术】
[0002] 茯苓多糖是茯苓的重要化学成分之一，近代临床及药理研究表明，茯苓多糖具有 很好的抗肿瘤作用，该多糖具有增强巨噬细胞和T淋巴细胞的细胞毒作用，还能增强细胞 的免疫反应并激活机体对肿瘤的免疫检测系统，具有一定的抗肿瘤功效。然而，茯苓多糖由 于提取工艺落后，得到的产品呈黄褐色，这是由于茯苓多糖中色素含量较多，影响了茯苓多 糖的色泽，不仅如此，常规工艺提取的茯苓多糖对小鼠 Lewis肺癌肿瘤的抑制有效率仅为 19. 6%~35%〇
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种茯苓多糖的提取方法，该方法得到的茯苓多 糖纯度高，且抗肿瘤活性好。
[0004] 本发明提供的技术方案是茯苓多糖的提取方法，包括以下步骤：
[0005] 1)将茯苓破碎，用6~12倍重量80~95v%乙醇回流提取2~3次，每次回流 2~3h，过滤，取滤渣备用；
[0006] 2)将滤渣用6~12倍重量的水回流提取2~3次，每次提取2~3h，过滤，收集 滤液备用；
[0007] 3)将滤液浓缩至60°C下相对密度为I. 1~1. 3的浸膏，加入乙醇沉淀，离心得沉 淀；
[0008] 4)将沉淀依次用2~4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2~ 4倍蒸馏水溶解，过截留分子量为6万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分 子量为10万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；
[0009] 5)取滤液喷雾干燥，即为茯苓多糖。
[0010] 步骤3)中，往浸膏中加入90~95v%的乙醇至乙醇含量为80~85v%。
[0011] 步骤4)中，洗涤后的沉淀溶于蒸馏水后，先过截留分子量为6万的中空纤维膜，这 样活性分子量低于6万的多糖以及低聚糖、单糖和色素均随着透过液流出，收集的浓缩液 过截留分子量为10万的中空纤维膜，大分子蛋白质以及分子量高于10万的多糖被截留，收 集透过液。
[0012] 本发明两次过中空纤维膜，不仅可以最大程度地去除杂质和色素，以保证成品纯 度和色泽，且提取得到的茯苓多糖分子量在6万~10万之间，其抗肿瘤活性比其他区间范 围内的多糖活性要高。
【具体实施方式】
[0013] 以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
[0014] 实施例1
[0015] 1)将茯苓破碎，用6倍重量80v%乙醇回流提取2次，每次回流2h，过滤，取滤渣备 用；
[0016] 2)将滤渣用6倍重量的水回流提取2次，每次提取2h，过滤，收集滤液备用；
[0017] 3)将滤液浓缩至60°C下相对密度为I. 1的浸膏，往浸膏中加入90v%的乙醇至乙 醇含量为80v%沉淀，离心，得到沉淀；
[0018] 4)将沉淀依次用2倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2倍蒸馏 水溶解，过截留分子量为6万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量为10 万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；
[0019] 5)取滤液喷雾干燥，即为茯苓多糖。用苯酚-硫酸法测定多糖含量为90. 9%，颜 色为白色。
[0020] 对照组
[0021] 1)将茯苓破碎，用6倍重量80v%乙醇回流提取2次，每次回流2h，过滤，取滤渣备 用；
[0022] 2)将滤渣用6倍重量的水回流提取2次，每次提取2h，过滤，收集滤液备用；
[0023] 3)将滤液浓缩至60°C下相对密度为I. 1的浸膏，往浸膏中加入90v%的乙醇至乙 醇含量为80v%沉淀，离心，得到沉淀；
[0024] 4)将沉淀依次用2倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2倍蒸馏 水溶解，上D303型大孔树脂，用水洗脱至流出液无色透明，收集流出液，浓缩，喷雾干燥，即 为茯苓多糖。用苯酚-硫酸法测定多糖含量为86. 0%，颜色为浅黄色。
[0025] 实施例2
[0026] 1)将茯苓破碎，用12倍重量95v%乙醇回流提取3次，每次回流3h，过滤，取滤渣 备用；
[0027] 2)将滤渣用12倍重量的水回流提取3次，每次提取3h，过滤，收集滤液备用；
[0028] 3)将滤液浓缩至60°C下相对密度为1. 3的浸膏，往浸膏中加入95v%的乙醇至乙 醇含量为85v%沉淀，离心，得到沉淀；
[0029] 4)将沉淀依次用4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用4倍蒸馏 水溶解，过截留分子量为6万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量为10 万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；
[0030] 5)取滤液喷雾干燥，即为茯苓多糖。用苯酚-硫酸法测定多糖含量为91. 3%，颜 色为白色。
[0031] 实施例3
[0032] 1)将茯苓破碎，用10倍重量90v%乙醇回流提取2次，每次回流2h，过滤，取滤渣 备用；
[0033] 2)将滤渣用10倍重量的水回流提取2次，每次提取2h，过滤，收集滤液备用；
[0034] 3)将滤液浓缩至60°C下相对密度为1. 2的浸膏，往浸膏中加入95v%的乙醇至乙 醇含量为85v%沉淀，离心，得到沉淀；
[0035] 4)将沉淀依次用3倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用3倍蒸馏 水溶解，过截留分子量为6万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量为10 万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；
[0036] 5)取滤液喷雾干燥，即为茯苓多糖。用苯酚-硫酸法测定多糖含量为91. 6%，颜 色为白色。
[0037] 为验证本发明的茯苓多糖具有较强的免疫促进作用，现进行以下动物实验。
[0038] 1、抗Lewis肺癌活性实验
[0039] 取清洁级C57BL/6小鼠30只，小鼠体重18~20g，随机分为3组，每组10只，分别 为实验组，阴性对照组和阳性对照组。
[0040] 取生长旺盛的小鼠 Lewis肺癌肿瘤细胞以常规方法制成匀浆约1~2X 107cfu/ml 的癌细胞悬浮液，于每只小鼠的右腋皮下接种〇. 2ml癌细胞悬浮液，24h后，各组开始每日 口服给药一次，实验组给药实施例1的茯苓多糖，阴性对照组给药生理盐水，阳性对照组给 药对照例1的茯苓多糖，给药剂量见下表1，连续给药10天。停药后次日处死所有动物，截 取足趾称重并计算肿瘤抑制率。肿瘤生长抑制率按下列公式计算，抑制率（％) = (阴性对 照组瘤重-实验组/阳性对照组瘤重）/阴性对照组瘤重X 100。
[0041 ]表 1
[0043] 注：与阴性对照组相比，*p < 0· 05，**p < 0· 01。
[0044] 由上表可知，米用常规方法提取的获等多糖对小鼠 Lewi s肺癌的抑制率达 32. 85%，而本发明提取的茯苓多糖对小鼠 Lewis肺癌的抑制率高达56. 25%，明显优于常 规茯苓多糖。
[0045] 2、抗C-26结肠癌活性实验
[0046] 取清洁级C57BL/6小鼠30只，小鼠体重18~20g，随机分为3组，每组10只，分别 为实验组，阴性对照组和阳性对照组。
[0047] 取生长旺盛的小鼠 C-26结肠癌肿瘤细胞以常规方法制成匀浆约1~2 X IO7Cfu/ ml的癌细胞悬浮液，于每只小鼠的右腋皮下接种0. 2ml癌细胞悬浮液，24h后，各组开始每 日口服给药一次，实验组给药实施例1的茯苓多糖，阴性对照组给药生理盐水，阳性对照组 给药对照例1的茯苓多糖，给药剂量见下表2,连续给药10天。停药后次日处死所有动物， 截取足趾称重并计算肿瘤抑制率。肿瘤生长抑制率按下列公式计算，抑制率（％) =(阴性 对照组瘤重-实验组/阳性对照组瘤重）/阴性对照组瘤重X 100。
[0048] 表 2
[0050] 注：与阴性对照组相比，，*p < 0· 05，**p < 0· 01。
[0051] 由上表可知，采用常规方法提取的茯苓多糖对小鼠 C-26结肠癌的抑制率达 26. 75%，而本发明提取的茯苓多糖对小鼠 Lewis肺癌的抑制率高达54. 52%，明显优于常 规茯苓多糖。
【主权项】
1. 茯苓多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 将茯苓破碎，用6~12倍重量80~95v%乙醇回流提取2~3次，每次回流2~ 3h，过滤，取滤渣备用； 2) 将滤渣用6~12倍重量的水回流提取2~3次，每次提取2~3h，过滤，收集滤液 备用； 3) 将滤液浓缩至60°C下相对密度为I. 1~1. 3的浸膏，加入乙醇沉淀，离心得沉淀； 4) 将沉淀依次用2~4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2~4倍 蒸馏水溶解，过截留分子量为6万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量 为10万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用； 5) 取滤液喷雾干燥，即为茯苓多糖。2. 根据权利要求1所述的茯苓多糖的提取方法，其特征在于：步骤3)中，往浸膏中加 入90~95v%的乙醇至乙醇含量为80~85v%。
【专利摘要】本发明公开了一种茯苓多糖的提取方法，包括以下步骤：1)将茯苓乙醇提取，取滤渣备用；2)将滤渣水提，收集滤液备用；3)将滤液浓缩浸膏，乙醇沉淀，离心得沉淀；4)将沉淀依次无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用蒸馏水溶解，过截留分子量为6万的中空纤维膜，收集浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量为10万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；5)取滤液喷雾干燥，即为茯苓多糖。本发明的茯苓多糖纯度高，色泽洁白，且抗肿瘤活性强。
【IPC分类】C08B37/00
【公开号】CN105061627
【申请号】CN201510542528
【发明人】文继承
【申请人】桂林茗兴生物科技有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月31日