专利名称：快速获得具有希望的形态的晶体的方法
技术领域：
本发明涉及结晶作用，特别是获得具有希望的形态的蛋白质晶体的方法。
在PCT公开号WO89/08703中，描述了一种枯草杆菌蛋白酶的结晶方法，方法是向至少约40克每升的浓缩枯草杆菌蛋白酶溶液中加入卤化物盐，如氯化钠或氯化钙。
在EP506,866中，描述了一种酶结晶的方法，其特征在于使用含有相对较高酶纯度、酶浓度约为至少5克每升的液体的水溶液作为原材料，并加入一种易溶的非卤化物型盐作为结晶剂，至大大低于以非晶形沉淀酶所需的量的浓度。例如某些枯草杆菌蛋白酶在高达30℃下的结晶。用硫酸钠帮助纯化蛋白质酶产物而不是结晶。
不管酶结晶领域的进展如何，适于大规模生产的便宜且有效的蛋白酶结晶在工业上仍有问题。以工业规模快速生产具有希望的形态的晶体的能力将意味着大量的节约，并且对于工业是非常重要的。
本发明的方法特别可用于快速获得具有希望的形态的蛋白质晶体，如酶。在一个实施方案中，用该方法在不到25小时内实现含酶溶液至少约90％的结晶，酶晶体具有主要是正方形片状的形态。
通过下列详述及附图
和附加的权利要求书，本发明的其他特征、方面和优点将是明显的。
图2是一张显微照片，显示在约19.5小时内从保持在约30℃下的溶液结晶所获得的蛋白酶晶体。
图3是一张显微照片，显示在约19.5小时内从保持在约15℃下的溶液结晶所获得的蛋白酶晶体。
图4是一张显示根据本发明所述获得的蛋白酶晶体的显微照片，其中结晶在约15℃下开始约4小时，然后在温度改变为约22℃时再继续18小时。注意到大量的正方形片状晶体。
发明详述本发明提供一种结晶方法，其中选择起始温度，如低于室温，以获得希望的晶体形态(例如正方形片状)。然后进行温度变化，例如至室温或以上，此时晶体以希望的方式继续生长，但具有不同的动力学，例如较高的结晶速度。因此，该方法以较高的结晶速度产生具有希望的形态的结晶产物。
一旦显示希望的形态的晶体在起始温度下开始形成，即可选择合适的温度变化来消除或使进一步的成核达到最小，从而阻止形成具有不希望的形态的晶体。例如，能在一定时间内以不连续的步幅升高温度(例如，在约25分钟内，以每5分钟约4℃的增量)。或者，能确定使进一步的成核最小的连续斜线上升方案。这种斜线上升方案能代表稳定速率提高，例如，在约10分钟的变化期内2℃/分钟，或在变化期内速度可能不同，例如，1℃/分钟10分钟，改变为2℃/分钟5分钟。
在利用结晶法回收蛋白质过程中，必须平衡许多因素以产生具有希望的形态的晶体，包括温度、pH、所使用的盐、结晶时间长度、晶体形态。
在本发明范围内的蛋白质包括药学上重要的蛋白质，如激素或其他治疗蛋白质，和工业上重要的蛋白质，如酶。
优选的酶包括那些能水解底物如菌株的酶。这些酶被称为水解酶，包括但不限于蛋白酶(细菌、真菌，酸性、中性或碱性)、淀粉酶(α或β)、脂肪酶、纤维素酶及其混合物。特别优选的酶是枯草杆菌蛋白酶和纤维素酶。最优选的是枯草杆菌蛋白酶，如美国专利4,760,025、欧洲专利130756 B1和欧洲专利申请WO91/06637所述，在此引用作为参考。能在本发明中使用的其他酶包括氧化酶、转移酶、脱水酶、还原酶、半纤维素酶和异构酶。
由已删除、替换或另外操作的蛋白质的一个或多个氨基酸之DNA序列衍生的遗传修饰蛋白酶也被认为在本发明的范围内。这些修饰蛋白质在例如PCT公开号WO95/10615和美国专利5,185,258中描述。
优选地，用本发明的结晶法回收的酶保留原始活性的至少80％、更优选地至少90％、最优选地至少95％。
用于培养细胞和生产蛋白质的发酵方法在本领域中周知。例如，能通过固体或浸没培养包括分批、分批补料和连续流动方法生产蛋白质。从发酵液中回收和纯化蛋白质也可通过本领域周知的方法实现。
用作根据本发明的方法的原材料的水溶液来源于合适的微生物发酵产生的发酵液。发酵液通常含有细胞碎片，包括细胞、多种悬浮固体及其他生物质污染物，以及希望的蛋白酶产物，优选地通过本领域周知的方法从发酵液中除去。进行这种去除的合适方法包括常规固体-液体分离技术，如离心、过滤、透析、微过滤、旋转式真空过滤或其他已知方法，来生产无细胞滤液。尽管预期直接由发酵液或无细胞滤液结晶蛋白酶在本发明范围之内，但优选地在结晶前用如超滤、蒸发或沉淀的技术浓缩发酵液或无细胞滤液。
至于酶，在本领域中早就已知，某些成分—如果在培养基中含有—将导致成分酶结晶困难。为此，通过例如对滤过液施行柱纯化，进一步纯化滤过发酵液以除去可干扰结晶的杂质通常是有利的。另外，通过控制培养微生物的培养基能限制这些杂质的量。例如，如Northrup等人(1948)《结晶酶》，哥伦比亚大学出版社，第254页所述，粘蛋白样物质(如多糖)对结晶方法通常不利。因此，通过从预发酵培养基中除去这些多糖成分，或从发酵液中纯化这些成分，能提高随后结晶的成功率。此外，通过用强酸、氢氧化铜、醇或丙酮处理滤过液，也能除去这些物质。优选地，在纯化含蛋白酶发酵液中使用硫酸铝以促进结晶。
许多不同的蛋白质在不同温度下显示不同的形态，包括酶，如某些蛋白酶和葡萄糖异构酶。通常优选在较低温度下发现的晶体形态。根据本发明，能用该因素以较高的结晶速度生产具有优选的晶体形态的晶体。
优选的晶体形态是在处理晶体时不易破裂的形态。杆形比方形、矩形或六边形晶体更易破裂。
下列实施例是代表性的，而非意在限制。
实施例
2.轻轻混合，加入5％NaCl。
3.对于所有实验，除实验2之外，溶液均保持在指定温度下，待4小时后从实验#1中提取样品，并轻轻混合在22℃下温育。
4.通过在显微镜下检查样品，观察一定时间的晶体性质。
5.测定一定时间内上清液中保留的活性，并计算百分结晶。
表1
在实验2中，不希望被理论所束缚，开始时的低温似乎产生正方形核，但是一旦置于较高温度下，某些晶体即按照杆形生长。这些组合已经产生矩形片和某些杆形。
在阅读本公开内容后，本领域技术人员将明白那些不背离本发明精神和范围的其他不同的实施例和前面描述和实施例的修改，旨在使所有这些实施例或修改均包含于附加权利要求书的范围内。此处的所有公开文本和专利在此均完整引用作为参考。
权利要求
1.一种蛋白质结晶方法，包括(a)制备一种含有该蛋白质的水性溶液；和(b)向该水性溶液中加入盐形成蛋白质/盐溶液；(c)将该蛋白质/盐溶液置于约4℃-20℃的温度下；(d)使晶核形成；(e)将(d)的溶液置于约22℃-60℃的温度下，使得发生较快速的结晶。
2.权利要求1的方法，其在步骤(e)之后进一步包括从该溶液中回收具有希望的形态的蛋白质晶体的步骤。
3.权利要求2的方法，其中该蛋白质是一种酶，而回收的晶体酶保留其原始活性的至少约90％。
4.权利要求1的方法，其中该水性溶液来源于所选择的微生物发酵产生的发酵液。
5.权利要求4的方法，其中从发酵液中除去其中存在的细胞碎片，以产生无细胞滤液。
6.权利要求4的方法，其中在结晶之前浓缩该水性溶液。
7.权利要求4的方法，其中该水性溶液是发酵液的超滤浓缩液。
8.权利要求1的方法，其中该蛋白质是一种酶。
9.权利要求8的方法，其中该酶是一种水解酶。
10.权利要求8的方法，其中该酶选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、氧化酶、转移酶、脱水酶、还原酶、半纤维素酶、异构酶及其任一混合物。
11.权利要求1的方法，其中步骤(e)的结晶产生具有希望的形态的晶体，该形态选自正方形、矩形或六角形。
12.权利要求11的方法，其中至少一部分晶体是正方形片。
13.权利要求1的方法，其中在步骤(c)中，水性溶液保持于约4℃-20℃下不超过约5小时。
14.权利要求1的方法，其中在步骤(e)中，水性溶液保持于约22℃-60℃下不超过约20小时。
15.一种由含酶溶液结晶该酶的方法，包括(a)将该溶液置于不高于约22℃的第一温度下；(b)使具有希望的形态的晶体形成，而该溶液保持于所述第一温度下；然后(c)将(b)的溶液置于高于所述第一温度的第二温度下，使得具有希望的形态的晶体之结晶速度提高。
16.权利要求15的方法，其在步骤(c)之后进一步包括回收具有希望的形态的晶体。
17.权利要求15的方法，其中该溶液中至少约90％的酶在开始步骤(b)之后的约25小时内结晶。
18.权利要求15的方法，其中所述第一温度低于20℃。
19.权利要求17的方法，其中所述第二温度至少为20℃。
20.一种按照权利要求15的方法生产的酶晶体。
全文摘要
本发明提供一种结晶方法,其中选择起始温度以获得希望的晶体形态(例如正方形)。假如温度变化不足以引起进一步的成核,则进行温度变化,此时晶体以希望的方式继续生长,但具有不同的动力学,例如较高的结晶速度。因此,该方法以较高的结晶速度产生具有希望的形态的结晶产物。
文档编号C30B7/00GK1342198SQ00804627
公开日2002年3月27日 申请日期2000年3月3日 优先权日1999年3月5日
发明者M·H·亨 申请人:金克克国际有限公司