专利名称：以氨基酸配对为基础的自组装肽和方法
技术领域：
本发明涉及形成纳米结构的自组装肽，制备多肽的方法和此类肽的用途。
背景技术：
由于非共价相互作用，分子自发地组装成良好有序的排列被称为“分子自组装”。 由此产生的超分子结构通常提供了非常明确的宏观属性的纳米构造。(Whitesides et al.，(1991)，Science 254:1312-1319 "Whitesides et al. (1991)”)。这些实体的自组装能力已成为这些实体作为新型材料开发成过程中的关键因 素。例如，过去十年研究发现生物聚合物的分子自组装在发现和设计生物材料在医疗技 术领域的应用中起着关键作用，更具体而言，是在再生医学和药物递送系统方面起关键 作用(Langer and Vacanti(1993)Science 260 920-926 ；Hubbell (1996)MRS Bulletin 21(11) 33-35)。纳米技术的一个重要问题是自发形成的高度有序的纳米级结构(Whitesides et al. (1991 年)，Zhang (2003 年)Biotechnology 21 :1171_1178，Lazzari et al. (2006) J. Nanosci. Nanotechnol. 6 =892-905)。简单的构建模块，如肽，能相互识别和组装，这种方 式指导其形成有序纳米结构。几种不同的共价相互作用的综合，包含静电相互作用、氢键、 疏水相互作用和芳香堆积相互作用，指导形成构造。自组装肽最近正成为在生物纳米技术研究中最有前途的生物分子材料(Zhang et al (1993)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90 3334-3338 ；"Zhang et al(1993) " ；Chen(2005) Colloids Surf. A 261 3-24 ；"Chen (2005) ，，；Zhang (2002) Biotechnol. Adv. 20 321-339 ' Zhang(2002) ‘ ；Aggeli et al. (1999)Mol. Med. Today 5:512-513" Aggeli et al. (1999) 〃 ；and Zhang et al. (1994)Biopoly. 34 :663_672)。自组装肽，不仅涉 及到许多的天然蛋白质的状态，如淀粉蛋白纤维化(amyloidfibrillogenesis) (Aggeli et al(1999))，而且还提供了有用的用于制造超分子的各种生物分子构建模(Zhang et al. (1993) ；Chen(2005) ；Zhang(2002))。离子互补两亲性肽是一类新型的自组装肽，例如EAK由谷氨酸(E)，丙氨酸(A)和 赖氨酸(K)组成(Zhang et al. (1993)和美国专利第 5，670，483to Zhang et al.)。这个 新肽起源于zuotin，一种倾向于与左旋的Z-DNA结合的酵母蛋白质(Zhang et al. 1993))。 这些多肽分子结构包含交替正电荷和负电荷，使离子互补。这种离子的互补性，加上氢键， 疏水性和范德华相互作用促进肽分子自组装成高度稳性的聚合体(Chen(2005) ；Hong et al. (2003) Biomacromol. 4 1433-1442" Hong et al. (2003) ” ；and Fung et al. (2003) Biophys. J.85 :537-548〃 Fung et al. (2003)”)。自组装肽所形成的纳米/微米构造在 生物医学领域具有广泛的应用，包含组织工程支架(Zhang et 15al. (1995) Biomater. 16 1385-1393and Holmes et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6728-6733)和生物表 面图样制作(Zhang (2002))。据近年报道，这些多肽可以封装疏水有机化合物和可调控地卸 载到细胞膜模型中(Keyes-Bag et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126 :7522_7532)。
EAKI6-II是一个以离子互补型氨基酸为基础的自组装肽的例子。在云母表面， EAK16-II肽以浓度依赖的方式自组装成多种结构，。(Jun et al. (2004)Biophys. J. 87 1249-1259)。EAK16-II 的临界聚集浓度(CAC)被确定为 0. 06mM(Fung et al. 2003)) 此 外，该EAK肽的序列显示是肽聚集形成纳米结构一个关键的决定因素，(Jim et al. (2004) Biophys. J. 87 1249-1259)。pH 值也是影响肽聚集关键因素(Hong et al. (2003))。在多种与蛋白质聚集疾病相关的形成组装良好的淀粉纤维蛋白的短肽片断 中，Gazit 等人开展 了肽的自组装研究，(Azriel andGazit (2001) J. Biol. Chem. 276 3415634161 ；Gazit (2002)FASEB J. 16 77-83 ；Gazit (2002)Bioinformatics 18 880-883)。研究表明，具有3至6个氨基酸长度并且含有芳香残基的肽可形成淀粉样纤维 以进一步组装成 β 折叠(Maji et al. (2004)Tetrahedron 60:3251-3259)。由于这些短 肽具有可形成富含β折叠的纤维的能力，淀粉样肽可作为用来建立纳米电子器件的构建 模块(reviewed in Reches and Gazit (2006) Current Nanoscience 52:105-111)。苯丙氨酸二肽已被证明可以自组装成肽纳米管(Reches andGazit (2003) Science 300:625-627)。此后研究表明，自组装苯丙氨酸二肽可以用来形成肽纳米管和钼纳米粒子 复合材料(Song et al. (2004) Chern. Commun. 9 =1044-1045) 此外还有研究表明这种肽纳 米管还可应用于电化学纳米生物传感器(Yemini et al. (2005) NanoLetters 5:183-186)。美国专利第7179784号描述类表面活性剂的自组装肽可形成纳米管。所公开的肽 分子具体包含非极性不带电荷的侧链氨基酸和阳离子(带正电)和/或阴离子(带负电) 的侧链氨基酸。这些多肽是两亲性的，为避免其烃链与水接触而倾向于聚集。此类多肽分 子自组装的基本原则是形成一个分离碳氢化合物和水区的极性界面。美国专利申请公开号2002/0160471介绍了肽支架在各种组织修复和替换中的应 用。再一次，为此目的，此申请涉及采用互补的和结构上相容的具有交替疏水性和亲水性氨 基酸的两性自组装肽的应用。美国专利申请公开号2005/0164361公开了通过对照自组装肽的环境可以有助于 对照其成核及积聚增长过程。美国专利申请公开号2005/0181973描述了具有两类氨基酸结构域的自组装多 肽。第一个结构域含有交替疏水性和亲水性氨基酸，未经修改的氨基酸可以调节自组装成 宏观结构。第二个氨基酸结构域无法自己进行分子自组装。此申请中，该肽的典型的第二 个氨基酸结构域模仿自然存在蛋白质中(如基底膜的组成部分)具有生物活性的肽基序。美国专利申请公开号2005/0209145公开了自组装两性多肽能够通过特异的非共 价相互作用与生长因子结合。此申请公开的典型多肽包含一个烷基尾，一个可形成β折叠 的肽序列，及一个具有生物活性的肽序列。美国专利申请公开号2005/0272662介绍两性肽分子组合物，其中包含第一种两 性肽，具有亲水区和离子电荷，第二种两性肽具有亲水区和相反的离子电荷。每个亲水区都 跟一个生物信号相关。YIGSR和IKVAV是所公开肽的两个例子。美国专利申请公开号2006/0079454公开了由自组装肽聚合所形成的管状、平面 和球型的纳米结构。此申请中的肽包含芳香族氨基酸，可以完全由芳香族氨基酸组成，并且 不超过4个氨基酸的长度。美国专利申请公开号2006/0084607公开了具有交替亲水性和疏水氨基酸的两性肽链。此类肽含有至少8个氨基酸的长度、具有相容和互补的结构，可以自组装成β-折叠 片，以形成具有宏观结构的支架。大多数本领域已知的自组装的多肽都由交替疏水性和亲水性氨基酸或氨基酸片 段组成。仍然需要基于氨基酸性质而不是基于电荷来设计多肽。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了自我互补和组装成纳米结构的链肽。这些 肽的设计基于氨基酸的氨基酸配对性质。证明了此类肽可提高疏水药物溶解度。此种以 β “链肽为基础的纳米结构的多种应用包含药物递送，生物分子传感器和生物燃料电池的 应用。在一个实施例中，本发明提供了一种具有交替氢键质子供体氨基酸片段和氢键质 子受体的氨基酸片段的自我互补链肽，可以自我组装成纳米结构。此类多肽含有2至 40个氨基酸长度。此类多肽至少含有一个质子供体和一个质子受体片段，每个片段由至少 一个氨基酸组成。此种肽不是由交替的疏水性和亲水性氨基酸片段组成。在另一个实施例中，本发明提供的自我互补型链肽具有一种下列结构a) (AxByCz)wAz(I)，和b) (AxByCz)w(C' XB' yA' z)w (II)A、A'、B、B'、(和('，为可形成氢键的氨基酸，可以是质子供体或质子受体氨基 酸；X和y每个独立地为从1到10的整数，；Z是从0到10的一个整数；W是从1至20的一 个整数。A互补于A'，B互补于B'，C互补于C'。在另一个实施例中，本发明提供的自我 互补型β-链肽还可具有下列结构之一a)AxByCz- ；(III)，和b) AxByCz-Cz' By' Ax' (IV).A、A'、B、B'、(和('每个独立地是供体氨基酸或受体氨基酸，而且每个自我互 补。这些氨基酸可选自以下组成的组氢键供体氨基酸，氢键受体氨基酸，带正电荷的氨基 酸，带负电荷的氨基酸，范德华相互作用的氨基酸。A互补于A'，B互补于B'，C互补于 C'。在另一个实施例中，本发明提供了一种自我互补链肽，此链肽含有至少 一个氢键氨基酸对，至少一个离子互补氨基酸对，和至少一个疏水氨基酸对，以形成纳米结 构。该肽含有4至40个氨基酸的长度。在另一个实施例中，本发明提供了一种自组装纳米结构，此纳米结构是由具有下 列结构式中的一个多肽聚集而组成a) (AxByCz)wI ；和b) (AxByCz)wAxII.A、B、C均为选自质子供体和质子受体的氢键氨基酸；χ和y每个独立地是从1到 10的一个整数，ζ是从0到10的一个整数；w是从1至20的一个整数。此类自组装肽形成 的纳米结构是以下中的一种纳米纤维，纳米线，纳米薄膜和纳米球。在另一个实施例中，本发明提供了由具有通式(V)的肽的聚集单位组成的自组装 纳米结构
(AwBxAyCz)nAaBb(V).A、B和C均为选自下列组中的氨基酸疏水氨基酸，带电氨基酸和氢键氨基酸，并 且A、B和C是不同的氨基酸；w、x、y和ζ每个独立地是从1到5的整数，A和B每个独立地 是从0到2的整数，并且η是从1到10整数。自组装肽形成的纳米结构是以下的一种纳 米纤维、纳米线、纳米薄膜和纳米球。在另一个实施例中，本发明提供与治疗制剂结合的包含描述的链肽的药物组 合物。在另一实施例中，本发明提供了用于给病人递送材料的试剂盒，此试剂盒包含包 含自组装β _链肽和治疗剂的药物组合物、一种或更多种电解质，缓冲液，递送工具，适于 将一种或更多种其他成份与组合物混合到一起的容器，准备使用药物组合物的说明书，混 合组合物和其它成分的说明书，和将此组合物给予受试者的说明书。在一个实施例中，本发明提供了一种使用具有氨基酸配对特性的自组肽来制备纳 米结构的方法。该方法包含下列步骤设计链肽，其由与互补氨基酸至少能够形成下列 作用力的一种氢键、静电相互作用、疏水相互作用和范德华作用力的氨基酸组成；形成含 有2至40个氨基酸的链，该链含有至少一个氨基酸对，能够形成至少一种下列作用力氢 键、静电相互作用、疏水相互作用、以及范德华作用力，并具有互补性氨基酸对并与第二个 肽具有立体化学作用。在另一实施例中，本发明提供了一种检测目标的生物分子的方法。该方法包含下 列步骤通过肽的自组装从链肽形成纳米结构；将肽吸收到电极的表面，允许电子转移 和生物催化分子的固定；在纳米结构的肽包裹的表面偶联一个提供可检测信号的“报道”分 子；提供目标的生物分子。在另一实施例中，本发明提供了 一个使用β -链肽来确定蛋白质聚集疾病抑制剂 的方法。
本发明优选的实施方式的这些以及其它特征将在下面的描述中变得更明显，其中 附图可提供参考图1是一种基于氨基酸配对(AAP)的自组装肽设计的流程图。图2Α是芘在不含肽的情况下(0毫克/毫升)或在含有 ΕΑΚ16-ΙΙ (ΑΕΑΕΑΚΑΚΑΕΑΕΑΚΑΚ) (0.5毫克/毫升)的情况下在玻璃瓶中的照片。芘的化学结 构如下所示。图2Β是0. 1毫克/毫升玫瑰树碱在逐步减少的ΕΑΚ16-ΙΙ肽浓度(0. 5,0. 1和0 毫克/毫升)的情况下在玻璃瓶中的照片。最后瓶(最右)是一个没有ΕΑΚ16-ΙΙ肽的对 照。玫瑰树碱的化学结构列在下图。图3Α描述了芘从ΕΑΚ16-ΙΙ肽的释放速率，表达为芘浓度(测量单位为微摩尔/ 升)对时间(测量单位为小时)的函数(Keyes-Baiget al. (2004) J. Am. Chern. Soc. 126 7522-7532〃 KeyesBaiget al. (2004)")。图3B是在溶液中芘和EAK比例为78 1时的一个扫描电镜照片。虚线从图3A 中的扫描电镜照片延长至相应的芘释放曲线(fromKeyes-Baig et al. (2004))。
图3C是在溶液中芘和EAK比例为16 1时的一个扫描电镜照片。虚线从图3A 中的扫描电镜照片延长至相应的芘释放曲线(fromKeyes-Baig et al. (2004))。图4是β -淀粉样肽(1-42个氨基酸)在疏水性H0PG(高定向裂解石墨)表面 (A-C)和云母表面(D-H)上的原子力显微镜照片。图像之间的时间间隔为512s。(I)是 β-淀粉样肽氨基酸序列的示意图。箭头表明，Αβ在疏水石墨(HOPG)和云母表面上的组 装可能暗示分别在疏水性的脂膜内部和亲水性(带负电)头部的Αβ聚集。图5是ΕΑΚ16-ΙΙ肽的纳米纤维在云母表面成核和增长的示意图。肽单体以矩形 框表示。多肽上的电荷示意为(_和+)。图6是一种肽单体在云母表面上组装的示意图，肽内正电荷被吸引到带云母的负 电荷上。图中显示平放的两个多肽。图7是ΕΑΚ16-ΙΙ肽二聚体在不同ρΗ的溶液中在云母表面上组装的一系列示意 图Α)水(中性)；B) ImM HCL ；C) IOmM HCL ；D) ImM NaOH ；和 E) IOmM NaOH。在 IOmM NaOH 中，肽二聚体不吸附在云母表面上，无纤维形成。这说明了溶液ρΗ值调控在云母上的表面 辅助的肽组装。图8显示了由能够形成氢键的氨基酸组成的本发明的肽的化学结构。在合成的肽 中，氢键对的排列根据重复对单3位的数量(肽长度)而变化，例如QN和NS对应QNQN和 NSNS或NSNSNSNS，也可根据重复单位本身而设计(如QN与QQNN)。图9A是用肽QN、QNQN、QQNN和NS4 (NSNSNSNS)的傅里叶变换红外光谱(FTIR)图， 相对波数(cm—1)绘制吸收图谱。FTIR光谱可确定肽在表面(干燥的)上所形成的二级结 构。图9B 是肽 QN、QNQN、QQNN和 NS4 (NSNSNSNS)的相对波长绘制的圆二色(CD) (mdeg) 光谱图。CD光谱可用来确定肽在本体溶液中的二级结构。图10是肽NS4、QNQN、QN、QQNN和单独ThT的硫磺素T (ThT)检测法的荧光光谱测 定图。以标准化的强度对波长(nm)作图。ThT荧光增强与在溶液中所形成的β-折叠的大
量存在有关。图IlA是QN肽(肽浓度为0. lmg/ml)的扫描电子显微镜(SEM)的图像。图IlB是QNQN肽(肽浓度为0. lmg/ml)的扫描电子显微镜图像。图IlC是QQNN肽(肽浓度为0. lmg/ml)的扫描电子显微镜图像。图IlD是NS肽(肽浓度为0. lmg/ml)的扫描电子显微镜图像。图IlE是NSNS (肽浓度为0. lmg/ml)的扫描电子显微镜图像。图IlF是NSNSN (肽浓度为0. lmg/ml)的扫描电子显微镜图像。图IlG是NSNSNSNS (肽浓度为0. lmg/ml)的扫描电子显微镜图像。图12A是各种浓度NS4肽(mM)的ThT检测法的荧光光谱数据图象。图中箭头指 向的ThT荧光峰根据肽的浓度的增加而增加。标准化的强度对波长(nm)作图。图12B是图12A中绘制的标准化的强度值对浓度(μ M)的Log值的数据的图像。 图中箭头所指的峰为临界聚集浓度(CAC)。图13A是本发明的AC8肽(FEFQFNH0的化学结构示意图。图13B是AC8肽分子结构示意图。箭头所指为一对离子键对，一对氢键(HB)对和 疏水残基。
图14A是各种浓度的AC8肽的表面张力相对时间的函数的图(测量单位mj/m2)。图14B是图14A中的一个平衡表面张力作为多肽浓度(μ M)的函数的图。两条直 线相交点为CAC。图15Α是对于AC8肽相对波长(nm)绘制的荧光强度(a. u.)的ThT荧光光谱图。 图15B是相对肽浓度(μΜ)绘制的图15Α中ThT荧光光谱图。图中两条直线相交点说明 AC8 的 CAC 为约 20 μ Μ。图16Α是AC8肽相对波长(nm)绘制的8_苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-l-napht halenesulfonic acid,ANS)检测法的荧光光谱(a. u.)图。箭头表明荧光峰出现在475nm。图16B是图16A中的ANS荧光光谱数据相对肽浓度(μ Μ)绘制的图。这两个直线 相交点显示AC8的CAC为20微摩尔。图17Α是AC8肽的标准化光强度对肽浓度(微摩尔/升)的静态光强度图。图中 两条直线相交点说明AC8的CAC接近20微摩尔/升。图17Β不同浓度的AC8肽大小尺寸(水力直径，nm)分布(％ )图。图18A是2.2微摩尔/升AC8肽自组装结构的一个原子力显微镜图像。图18B是5微摩尔/升AC8肽自组装结构的一个原子力显微镜图像。图18C是10微摩尔/升AC8肽自组装结构的一个原子力显微镜图像。图18D是40微摩尔/升AC8肽自组装结构的一个原子力显微镜图像。图18E是87微摩尔/升AC8肽自组装结构的一个原子力显微镜图像。图18F是利用AC8肽的红外吸收光谱图，相对波数绘制的吸收图，表明AC8肽形成 大量的折叠二级结构图19是AC8肽单体浓度低于CAC(左侧)及高于CAC(右侧)时的组装示意图，其 中AC8浓度高于CAC时产生成熟纤维，原细纤维和肽单体的混合物。图20Α是与单独的EAK肽相比(蓝色条)，在不同浓度的EAK肽(微克/毫升)与 玫瑰树碱(红色条)存在下，MCF-7的细胞存活度(测量为％存活度)的图。黑色和绿色 条分别为代表细胞培养液和水溶剂的对照。图20Β是不同浓度的EAK肽(毫克/毫升)或水与0. 1毫克/毫升玫瑰树碱在玻 璃小瓶中的照片。图20C是0. 1毫克/毫升玫瑰树碱与0. 5毫克/毫升EAK肽的扫描电镜照片。图20D是0. 1毫克/毫升玫瑰树碱与0. 1毫克/毫升EAK肽的扫描电镜照片。图20Ε是仅有0. 1毫克/毫升玫瑰树碱在水溶液中的扫描电镜照片。图21Α是在各种不同浓液中(细胞培养基，Η20，3. 3%二甲基亚砜)，单独玫瑰树碱 (0. 1毫克/毫升)，或存在(红色条)或不存在玫瑰树碱时(蓝色条)0. 1毫克/毫升的各 种不同多肽(EAK-P，EAKK, EFK, NS4, FEQNK, QN, QNQN 或 QQNN)时，Α549 细胞的存活度。所 有有关多肽存在的细胞存活度实验的细胞培养都是在有血清的条件下进行的。图21Β是在各种不同浓液中(细胞培养基，Η20，3.3%二甲基亚砜)，单独玫瑰树碱 (0. 1毫克/毫升)，或存在(深色条)或不存在玫瑰树碱时(淡色条)各种不同肽(ΕΑΚ-ρ， EAKK, EFK, NS4, FEQNK, QN, QNQN或QQNN)中Α549细胞的存活度。所有有关多肽存在的细 胞存活度实验的细胞培养都是在4小时无血清的条件下进行的。图22是对于各种不同多肽，在玫瑰树碱(EPT)存在时，发射荧光(标准化强度)对波长(nm)的图。箭头分别指向晶体形式的EPT，电中性EPT和质子化的EPT。图23A是在各种不同浓度AC8肽中(微摩尔/升)同时在1. 33%的二甲基亚砜中 含有0. 04毫克/毫升玫瑰树碱(EPT)的发射荧光(标准化强度)对波长(nm)的图，表明 AC8肽具有溶解EPT的能力。图23B是图23A中荧光强度对肽浓度绘制的图，表明肽溶解EPT的能力与其本身 浓度相关。图24A是在各种对照介质中(1.3%二甲基亚砜，PBS，H20，单独培养基)A549细胞 的存活度。图24B是在各种浓度EAK及1.3% 二甲基亚砜条件下，在含有(红色条)及不含 (蓝色条)EPT时A549细胞的存活度。图24C是在各种对照液中(1. 3%二甲基亚砜，磷酸盐缓冲溶液，水，培养基)MCF-7 细胞的存活度。图24D是在各种浓度EAK及1.3%二甲基亚砜条件下，在含有(红色条)及不含 (蓝色条)EPT时MCF-7细胞的存活度。图24E是5，9和100微克/毫升AC8与0. 04毫克/毫升EPT的荧光发射光谱。溶 液中含有1. 3%二甲基亚砜。该溶液对A549和MCF-7两种细胞进行了测试，数据如图24B 和D所示。图25A描绘在仅有培养基，水，各种浓度的EAK肽(125或25微克/毫升)，25微 克/毫升AC8肽，EPT与水溶液(EPT-H ；25微克/毫升)，或玫瑰树碱溶在二甲基亚砜中 (EPT-D ；25微克/毫升)条件下，在不同时间点直到48小时的治疗过程中(时间间隔表示 在该图的顶部)，A549细胞的存活度。所有肽-EPT组合的制备均不含二甲基亚砜。红/暗 紫色条代表存在EPT与多肽，而蓝/浅紫色条代表仅有肽。图25B显示如图25A的MCF-7细胞类似的数据。图26A是描绘在培养基，水，或各种浓度的AC8肽(微克/毫升)在有(红色条) 及无EPT(蓝色条)时A549细胞的存活度的条形图。图26B描绘了在存在玫瑰树碱(EPT)时AC8肽稀释效应对A549存活度的条形图。 (Dl = 2倍稀释；D2 = 4倍稀释；D3 = 8倍稀释，D4 = 16倍稀释)。图26C是描绘在培养基，水，或各种浓度的AC8肽(微克/毫升)在有(红色条) 及无EPT(蓝色条)时MCF-7细胞的存活度的条形图。图26D描绘了在存在玫瑰树碱(EPT)时AC8肽稀释效应对MCF-7存活度的条形图。 (Dl = 2倍稀释；D2 = 4倍稀释；D3 = 8倍稀释，D4 = 16倍稀释)。图27A是不同浓度的AC8肽(毫克/毫升)与0. 04毫克/毫升玫瑰树碱的发射 荧光(标准化强度)对波长(nm)的函数。图27B相对图27A中的波长绘制的荧光发射的放大图。图27C是描绘在培养基，水，或各种浓度的AC8肽(微克/毫升)在有(红色条) 及无EPT(蓝色条)时A549细胞的存活度的条形图。图27D描绘了在存在玫瑰树碱(EPT)时，AC8肽稀释效应对A549存活度的条形图。 (Dl = 2倍稀释；D2 = 4倍稀释；D3 = 8倍稀释，D4 = 16倍稀释)。图27E是描绘在培养基，水，或各种浓度的AC8肽(微克/毫升)在有(红色条)及无EPT(蓝色条)时MCF-7细胞的存活度的条形图。图27F描绘在存在玫瑰树碱(EPT)时，AC8肽稀释效应对MCF-7存活度的条形图。 (Dl = 2倍稀释；D2 = 4倍稀释；D3 = 8倍稀释，D4 = 16倍稀释)。图28 是在 pH4 (A-C)和 pH7 (D-F)条件下，各种浓度的 dG16(A，D)、dG16(B, Ε)和 dGC16 (C，F)寡核苷酸的Δ ODr对总EAK肽浓度的函数的一系列点图。图29是EAK肽结合dG16，dC16和dGC16的v/Pf对ν函数的对点图，pH4 (A)和ρΗ7⑶。图30是EAK肽溶液与3. 6微摩尔/升的(A) FAM_dGC16在pH4 (激发波长为452nm， 发射波长为514nm) ； (B) FAM_dGC16，在pH 7 (激发波长为494nm，发射波长为514nm) ； (C) FAM-dC16在pH4(激发波长为452nm，发射波长为514nm)；和(D)FAM_dC16在pH7 (激发波 长为494nm，发射波长为514nm)混合的上清液中的荧光各向异性的点图。图31是FAM-ClC16在加入EAK后所形成的聚集物中光的各向异性(〇)和计算的 百分比(■)。图32是dC16-Rh在有及无EAK时并在pH值为7条件下的紫外线吸收光谱。(A) 3. 9 微摩尔/升dC16-Rh( ·),60微摩尔/升EAK(+)，3. 9微摩尔/升dC16-Rh和60微摩尔/
升EAK，离心前Γ-)和离心后(X) ； (B)浓度围3.9(·)，2.0(~_)，1.3(Χ)微摩尔/升的
(!C16-Rh0图33是3. 6微摩尔/升dGC16与各种浓度EAK的混合物在㈧pH4和⑶pH7的 20%聚丙烯酰胺凝胶电泳的照片(0，6，60，120微摩尔/升EAK分别在第1，2，3，4跑道上)。图34是0. 1毫克/毫升EAK溶液含有Imol %的FAM-EAK在有(·)及无(o) (A) 3. 6 微摩尔/升dG16在pH4 (激发波长为452nm，发射波长为514纳米)；和(B) 4. 3微摩尔/升 dG16在pH7 (激发波长为494nm，发射波长为514纳米)条件下光的各向异性的对点图。图35是通过稳态光散射(SLS)获得的对点图，在(ο)缓冲液和含有(▲ ) 3. 6微 摩尔/升dG16和和0. 1毫克/毫升EAK，( □ ) 0. 1毫克/毫升ΕΑΚ，(χ) 3. 6微摩尔/升dG16 在(A)pH4和(B)pH7的溶液中。激发与发射波长均为350纳米。图36是EAK-寡核苷酸(ODN)复合物的原子力显微镜(AFM)图像，EAK-寡核苷酸 (ODN)复合物形成在含有3. 6微摩尔/升dG16和和0. 1毫克/毫升，pH值为4的溶液中， (A) 8分钟；(B) 60分钟；(C) 70分钟；及(D) 75分钟。图片C和D分别是标记的区域B和C 中的放大图。图37是动态光散射所测的EAK-ODN复合物的直径分布直方图。溶液含有7. 2微 摩尔/升dG16和和各种浓度的EAK，溶液pH值为4。仅有EAK样本的测定于在其制备后40 分钟，其浓度为0. 1毫克/毫升(60微摩尔/升)，仅有dG16的样本浓度为7. 2微摩尔/升。图38是3. 6微摩尔/升仅有荧光标记的dC16和其与0. 2毫克/毫升的EAK所形 成复合物在PH4溶液中被KI的荧光淬灭的Stern-Volmer图。实线代表适合在表_12中列 出参数的 Stern-Volmer 方程。(A) FAM_dC16 (A), FAM-dC16_EAK ( □)禾口 (B) dC16-Rh (A), dC16-Rh-EAK (D)0图39是0. 5毫克/毫升EAK16-II肽(用0. 22微米过滤器过滤)溶解于水，1毫 摩尔/升盐酸，10毫摩尔/升盐酸和10毫摩尔/升氢氧化钠的散射光强度(测量动态光散 射(DLS)的光吸收)对时间(小时)的绘制的图。图40是EAKI6-II肽纳米纤维在纯水中的云母表面从吸附的纳米纤维“种子”(上图)和纤维聚集团(下图)增长的原子力显微镜成像图。绿色箭头表示纳米纤维从“种子 的两个活化点”的增长和红色箭头指向参考点(上图)。图41是显示2微摩尔/升EAK16-II肽在云母表面在pH值逐渐增加条件下(分别 为10毫摩尔/升盐酸，1毫摩尔/升盐酸，水，1毫摩尔/升氢氧化钠，10毫摩尔/升氢氧 化钠)的纳米结构形成的一系列原子力显微镜图。线从各显微镜照片至相应PH条件下的 Zeta电位(毫伏)与溶液pH值的函数图。图42A是在各种PH值条件下(1毫摩尔/升盐酸，水，和1毫摩尔/升氢氧化钠)2 微摩尔/升EAK16-II肽纳米纤维在云母表面上增长速度(单位为纳米/秒)的频率图(单 位为％)。图42B是2微摩尔/升EAK16-II肽纳米纤维在各种pH值条件下在云母表面上平 均增长速率的表格。图43A是EAK16-II (0. 05毫克/毫升)在云母表面上，在水中成像的原子力显微镜 图。图43B是EAK16-II (0. 05毫克/毫升)在高定向裂解石墨表面上，在水中成像的原 子力显微镜图。图44A是肽单体在高定向裂解石墨表面自组装的示意图。箭头指示的方向为纳米 纤维的增长方向。为了最大限度形成多肽之间及多肽与裂解石墨表面的疏水相互作用力， 肽分子倾向于沿着HOPG晶格方向排列最多的碳原子。从而导致肽纳米纤维的方向成60或 120度角。图44B是10微摩尔/升EAK16-II肽在高定向裂解石墨表面上组装的原子力显微 镜成像图，显示纤维的方向成60或120度角，与图44A中高定向裂解石墨的晶格方向相像。图44C是一个EAK16-II肽单体示意图，表明基于肽的尺寸和HOPG的晶格其对高 定向裂解石墨晶格的覆盖。图45是肽修饰后表面两性变化的一系列显微照片(A)水滴在云母表面(无多 肽)；(B)水滴在EAK修饰的云母表面；(C)水滴在高定向裂解石墨表面和(D)水滴在EAK 修饰的高定向裂解石墨表面。图46A裸的高定向裂解石墨表面的原子力显微镜成像图和对应的截面分析。图46B是EAK肽改性的高定向裂解石墨表面的原子力显微镜图。图46C是葡萄糖氧化酶(GOx)分子在裸的高定向裂解石墨表面的原子力显微镜成 像图及其相应的截面分析。粗糙背景表示该GOx在高定向裂解石墨表面可能发生变性。图46D是葡萄糖氧化酶(GOx)分子在EAK肽改性的高定向裂解石墨表面的原子力 显微镜图。比图46C更多的球型GOx出现在改性的高定向裂解石墨表面上，显示表面改性 提供了 一种对GOx吸附更生物兼容性的环境。图47是EAK肽上的谷氨酸与酶如葡萄糖氧化酶上的氨基发生化学反应的示意图。 EDC 1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺；NHS =N-羟基琥珀酰亚胺。图48是描绘ΕΠ(肽修饰的和未修饰的高定向裂解石墨的电化学性能的1毫摩尔/ 升铁氰化钾在从2至100mV/S的不同扫描速率下的一系列循环伏安图。在低扫描速率下， EAKI6-II纳米纤维表面涂层不会明显阻止电子转移。图49是葡萄糖氧化酶固定于EAK肽修饰的高定向裂解石墨电极上的一个相对电压绘制电流的循环伏安图，银/氯化银电极为参比电极，扫描速率为2毫伏/秒。图50是20毫摩尔/升葡萄糖在葡萄糖氧化酶固定于EAK肽修饰的高定向裂解石 墨电极上氧化的电流(微安)对电压(伏)的图。银/氯化银电极为参比电极，电极的几 何表面积为1平方厘米。图5IA是不同浓度葡萄糖(0-20毫摩尔/升)在GOx固定的EAK肽/HOPG电极上 氧化的电流(微安)对时间(秒)的图。图51B是GOx固定的EAK肽/HOPG电极电流(微安)对葡萄糖的浓度(毫摩尔/ 升)的图。这些数据可以用来拟合下面的非线性回归方程，以获取最大电流Imax和酶-底 物复合物的米氏常数Km。Imax 最大电流，Kffl 酶-底物复合物的米氏常数。图52表示GOx-固定的EAK肽/HOPG电极贮存可长达一个月的稳定性图。图53表示GOx固定的EAK肽/HOPG电极具有较高的操作稳定性的图。图54A是一个应用GOx固定的EAK肽/HOPG电极作为生物燃料电池示意图。图54B是一个说明使用漆酶和氢化酶的02/H2生物燃料电池中电子和质子转移机 制的示意图。图55是一个基于修饰的EAK肽的自组装与电化学还原和加强步骤制造金属纳米 线的示意图。图56示出了在pH7. 3的HEPES缓冲液中siRNA与越来越高浓度的肽(从0到40 微摩尔/升)的吸收光谱。(从上到下)图57说明了在260纳米波长下，不同浓度siRNA的减色效应相对R9浓度的函数。 siRNA的浓度为1. 5微摩尔/升(ο)，3. 0微摩尔/升(■)和4. 5微摩尔/升(*)。实线 是用Prism产生的最佳线性拟合。误差线代表每个siRNA浓度下三个重复实验的标准差。图58说明了在260纳米波长下，不同浓度siRNA的减色效应相对正电荷/负电荷 比例的函数。siRNA的浓度为1. 5微摩尔/升(ο)，3. 0微摩尔/升(■)和4. 5微摩尔/ 升(*)。实线是用Prism产生的最佳线性拟合。图59是3. 0微摩尔/升的siRNA (上)和100微摩尔/升的R9 (下)在HEPES缓 冲液中(6毫摩尔/升HEPES-氢氧化钠，20毫摩尔/升氯化钠，0. 2毫摩尔/升氯化镁，pH 值7. 3)的圆二色谱图。光谱显示一个典型的siRNA的A-DNA结构和R9的无规则卷曲结构。图60说明了在pH7. 3HEPES缓冲液中siRNA与越来越高浓度的肽(从0到40微 摩尔/升)的圆二色谱图。(从上到下)图61说明了在260纳米波长下，siRNA的椭圆相对R9浓度的函数的相关变化。 siRNA的浓度为1. 5微摩尔/升(ο)，3. 0微摩尔/升(■)。实线是用Prism产生的最佳 线性拟合。图62说明了在260纳米波长下，siRNA的椭圆作为正电荷/负电荷比例的函数的 相对变化。siRNA的浓度为1. 5微摩尔/升(ο)，3. 0微摩尔/升(■)。实线是用Prism 产生的最佳线性拟合。图63说明了 1. 5微摩尔/升CTGFsiRNA_R9肽的复合物的水力直径和Zeta电位。 siRNA和siRNA-R9复合物的Zeta电位用实条表示；R9的Zeta电位用斜条表示；大小是由 实线表示。误差线是三个重复实验的标准差。图64说明了 siRNA(l. 5微摩尔/升)和siRNA_R9(l. 5微摩尔/升/150微摩尔/升)复合物在加入2摩尔/升盐后，对260纳米波长光的吸光度。siRNA单独的吸光度和 siRNA-R9复合物溶液的吸光度测试于在添加盐前(白色条)、添加盐后两小时(斜条)和 添加盐后一天(黑色条)。误差线来自于三个重复实验的标准差。图65说明了计算出的CTGF siRNA-R9复合物的结合等温线。根据Bujalowski和 洛曼发展出的分析方法，算出的自由肽浓度是错误的。图66说明了 EAKI6-II (AEAEAKAKAEAEAKAK)的分子结构；A是丙氨酸，E是谷氨酸 和K为赖氨酸。图67说明了肽-玫瑰树碱悬浮液中玫瑰树碱荧光光谱随着时间的变化。(A)玫瑰 树碱荧光光谱对时间的函数；(B)在468纳米(菱形)和520纳米(方形)下，玫瑰树碱标 准化荧光强度对时间的函数。玫瑰树碱浓度为1. 0毫克/毫升；肽浓度为0. 2毫克/毫升。图68显示0. 2毫克/毫升EAKI6-II溶液在机械搅拌前(菱形)和30小时后(方 形)对400nm光的静态光散射图。图69显示肽浓度对复合物形成的影响。肽_玫瑰树碱悬浮液中玫瑰树碱在468 纳米(A)和520纳米(B)的标准化荧光强度作为时间的函数。玫瑰树碱的浓度固定在1. 0 毫克/毫升，EAK16-II肽的浓度为0至0. 5毫克/毫升。图70显示玫瑰树碱浓度对复合物形成的影响。肽_玫瑰树碱悬浮液中玫瑰树碱 在468纳米(A)和520纳米(B)的标准化荧光强度作为时间的函数。EAK16-II肽的浓度为 0. 2和0. 5毫克/毫升，玫瑰树碱浓度为0. 1至1. 0毫克/毫升。图71说明了肽-玫瑰树碱悬浮液经过24小时机械搅拌后的玫瑰树碱荧光光谱。 玫瑰树碱浓度为0. 1毫克/毫升和肽浓度为0至0. 5毫克/毫升。插图为玫瑰树碱晶体的 荧光光谱。图72(A)玫瑰树碱荧光强度对时间的函数，显示玫瑰树碱从0. 05毫克/毫升 EAK16-II和0. 1毫克/毫升玫瑰树碱在鸡蛋卵磷脂囊泡中释放。(B)玫瑰树碱从不同的 肽-玫瑰树碱复合物中转移至鸡蛋卵磷脂囊泡的图。该复合物由0. 1毫克/毫升玫瑰树碱 与各种浓度的EAK16-II制成0. 05 (三角形)，0. 1 (十字叉)，0. 2 (方形)和0. 5毫克/毫 升(空心圆)。实线代表实验数据符合公式2或公式3的拟合曲线。激发和发射波长分别 为 295 和 436nm。图73是0. 1毫克/毫升玫瑰树碱与不同浓度EAK16-II肽复合物的扫描电镜照片 (a) 0.5毫克/毫升，(b) 0.2毫克/毫升和(c)0. 05毫克/毫升。图74 (a)是在加入不同比率的肽-玫瑰树碱复合物24小时后MCF-7细胞和A549 细胞的存活度；(b)经过一系列稀释后细胞的存活度。复合物的制备是在0. 1毫克/毫升 玫瑰树碱与0. 02至1. 0毫克/毫升不同浓度EAK16-II条件下进行的。图75是EAK16-II-玫瑰树碱复合物对MCF_7 (a)和A549 (b)细胞的时间依赖毒性 的函数。EPT-H2O为玫瑰树碱对照组(纯水)。图75. 1显示A549细胞(a)和MCF_7 (b)细胞摄取玫瑰树碱的荧光图像。绿颜色为 玫瑰树碱的荧光。第一列为相位对比图像，插图为其相应的荧光图像。*表示半曝光时间。图75. 2显示在37°C和4°C条件下，A549和MCF-7细胞对玫瑰树碱摄取的荧光图 像。绿颜色代表玫瑰树碱荧光。第一列显示相位对比图像，插图为其相应的荧光图像。图76是光强度为基础的鸡蛋卵磷脂囊泡粒径分布图。
图77是肽-玫瑰树碱的悬浮液经过24小时搅拌后的照片。玫瑰树碱浓度为0. 1
毫克/毫升并且肽的浓度为0至0. 5毫克/毫升。图78(a)各种浓度的玫瑰树碱在鸡蛋卵磷脂囊泡中的校准曲线。(b)图(a)中玫 瑰树碱相应的紫外吸收。图79显示随时间释稀5倍(实心)和稀释10倍(条纹)的溶液的相对紫外可 见光吸收度的变化(Δ( 》。溶液通过混合8. 6微摩尔/升dGI6与㈧10. 5微摩尔/ 升 EAK16-IV，pH 值为 4 ； (B) 48. 2 微摩尔 / 升 EAK16-IV，pH 值为 7 ； (C) 24. 1 微摩尔 / 升 EAK16-II，pH 值为 4，和(D) 60 微摩尔 / 升 EAK 16-11，pH 值为 7。图80说明(A) 5. 0微摩尔/升dC16和120微摩尔/升EAK16-II在pH值为4的 溶液中的吸收光谱。离心后溶液上清液的(χ)；待溶液干后，重悬于PH值为11的缓冲液中， 搅拌，对搅拌后的得到的溶液的离心前(□)和后(_)的吸收光谱。(B)为将在pH4(o)和 pH7 (·)的8. 6微摩尔/升dC16和0. 1毫克/毫升EAK16-IV混合，所得到的聚集物重新悬 浮于PH值为9. 5缓冲液后，其溶液的对紫外可见光吸收度的相应变化对时间的函数。图81显示8. 6微摩尔/升Fl-dC16-Rh溶液在有或无60微摩尔/升EAK16-IV在 PH4条件下的荧光光谱。制备后半小时，溶液用pH值为4的缓冲液稀释10倍，并且在25°C 保存1天。此EAK-ODN聚集物再与0. 7单位/微升的核酸外切酶混合。㈧无EAK16IV 20 分钟(Δ )，30分钟(+)，和对照实验，即无核酸酶(ο) ； (B)含有EAK16IV 20分钟(+)，60 分钟(Δ )，90分钟(-)和无处理对照(X)。制备1天后，溶液被离心处理。图82是标准化的ID/IA比例对降解ODN的百分比的校正曲线。ID/IA比例标准化 于完整的Fl-dC16-Rh。实线代表了适合公式，标准化ID/IA = AX降解ODN百分比+1的最 佳拟合曲线，其中 A = O. 0410士0. 002，R2 = 0. 999。图83说明(A) EAK肽序列对核酸酶降解寡核苷酸的保护作用的效应。约8. 6微摩 尔/升Fl-dC16-Rh与60微摩尔/升EAK16-IV或EAK16-II在pH 4 (斜条纹)或pH7 (实 心)条件下混合30分钟，然后再稀释10倍。1天后对该溶液离心。(B)显示在pH4(斜条 纹)或pH7 (实心)条件下稀释10倍后一天Fl-ClC16-Rh在EAK-ODN聚集物的比例。图84说明(A) 8. 6微摩尔/升Fl_dC16-Rh与10微摩尔/升EAK16-IV在pH4条件 下形成的EAK-ODN聚集物的荧光光谱。对照实验(X)，样品制备一天后，经过核酸酶处理 30分钟后再离心(■ )。(B)降解的寡核苷酸在EAK-ODN聚集物中的百分比对EAK16IV浓 度的函数。图85显示离心对8微摩尔/升Fl-ClC16-Rh与60微摩尔/升EAK16-IV在pH 4条 件下形成的EAK-ODN聚集物对核酸酶的抵抗的效应(A)样品制备30分钟后，溶液经离心 (□)或没有离心(·)，然后稀释10倍。24小时后，所生成的溶液与核酸外切酶I混合。 在不同时间测量寡核苷酸降解百分比；(B)制备30分钟后，对该溶液离心，再稀释10倍。大 约24小时后，记录所生成溶液(X)及其离心后上清液(·)的紫外-可见吸收光谱；(C) 寡核苷酸降解百分比。在EAK-dC16混合24h后，溶液离心一次，再在未来3天每天离心一 次。最终的溶液与核酸外切酶混合60分钟。图86说明了 EAK16-II，EAK16-IV和EFK16-II的分子结构和序列。N禾Π C端分另Ij 受乙酰化和酰胺化保护。图87说明了(a)EAK16_II，( )EAK16_IV和(c)EnQ6-II肽纳米结构的原子力显微镜图像。多肽浓度为0.5毫克/毫升。图中比例尺为200nm。图88三种肽EAK16-II，EAK16-IV和EHQ6-II和其组装物的反映其疏水性的动态 表面张力(a)和ANS荧光光谱图(b)。插图是无肽的情况下ANS的荧光对照图。肽浓度为 0. 5毫克/毫升，而ANS浓度为10微摩尔/升。图89说明了肽-玫瑰树碱复合物的形成。(a)玫瑰树碱与不同浓度的三种肽形 成的复合物的照片，在纯水中的玫瑰树碱作为对照。玫瑰树碱与不同浓度的EAK16-II (b)， EAK16-IV(C)和EHQ6-n(d)所形成的复合物的标准化荧光光谱，插图显示低浓度肽与复 合物的光谱。图90说明了在水溶液中，玫瑰树碱在三种肽EAK16-II，EAK16-IV和EHQ6-II溶 液中和缺乏肽条件下稳定的最高悬浮度(百分比)。图91是出了通过DLS0. 5毫克/毫升三种多肽EAKI6-II，EAKI6-IV和EFKI6-II 在纯水中的粒度分布(a) ；0. 5毫克/毫升EAKI6-II和EAKI6-IV与玫瑰树碱复合物在水溶 液中的粒度分布(b)。图92是三种肽EAKI6-II，EAKI6-IV和ΕΠ(Ι6-ΙΙ在不同肽浓度下与玫瑰树碱形成 复合物的扫描电镜照片像。玫瑰树碱晶体在纯水中作为对照。图93说明了不同浓度的三种肽EAKI6-II，EAKI6-IV和ΕΠ(Ι6-ΙΙ与玫瑰树碱的复 合物对Α549细胞(a)和MCF-7细胞(b)的毒性。未经处理的细胞的存活度为1 (M为细胞 经过培养基处理)。溶剂的对照实验为，纯水处理细胞(深绿色条)；药物对照实验为玫瑰 树碱仅溶于纯水(而没有肽)来处理细胞(浅绿色条)。蓝条代表在没有玫瑰树碱而仅有 肽的条件下的对照实验。图94 (A)说明了三种肽EAKI6-II，EAKI6-IV和ΕΠ(Ι6-ΙΙ在浓度为0. 5毫克/毫 升和不同浓度玫瑰树碱的复合物对Α549细胞(a)和MCF-7细胞(b)的毒性；(B)为上述复 合物经过系列稀释后对细胞的毒性。图95显示了 EAKI6-II的质谱图。图96显示了 ofEAKI6_IV的质谱图。图97显示了 ΕΠ(Ι6-ΙΙ的质谱图。图98说明了 ΕΑΚΙ6-ΙΙ的高效液相色谱数据。肽的纯度约为73%。图99说明了 EAKI6-IV的高效液相色谱数据。肽的纯度约为83%。
具体实施例方式本发明涉及自组装成各种纳米结构的肽。这些多肽的设计依据于每个氨基酸参与 氢键、静电作用、疏水和范德华相互作用的能力。由此产生的自组装纳米结构可以应用于多 种技术或生物医疗功能，包含药物递送和溶解度，生物传感器和生物燃料电池。在下面的说明书中，详载了许多具体的细节，进而提供对该项发明更透彻的理解。 然而，在此情况下，本领域的技术人员可以看到本发明可能具有实践性但却没有具体的首 选特色。在下面的描述中，提到了本领域的某些术语，其中一些定义如下。“氨基酸”的定义是20种必需的氨基酸的任意种。这些包含那些天然存在的以及 非天然存在的，例如D-天然氨基酸，β和γ衍生物。按照标准术语，氨基酸残基序列可用三个字母或一个字母的代码来命名，例如丙氨酸(Ala，Α)；精氨酸(Arg，R)的；天门冬酰 胺aSparigine(ASp，N)的；天门冬氨酸(天冬氨酸，D)，半胱氨酸(半胱氨酸，C)的；谷氨酰 胺(谷氨酰胺，Q)的；谷氨酸(谷氨酸，E)；甘氨酸(Gly，G)的；组氨酸(His，H)，异亮氨酸 (He, I)；亮氨酸(Leu，L)，赖氨酸(赖氨酸，L)，蛋氨酸(Met，Μ)；苯丙氨酸(丙氨酸，F)； 脯氨酸(Pro，P)的；丝氨酸(Ser，S)的；苏氨酸(苏氨酸，T)的；色氨酸(Trp，W)，酪氨酸 (Tyr, Y)的；和缬氨酸(Val, V)。术语“肽”是指本文中所使用的氨基酸链。特别是，肽是由2至40个氨基酸的长度。本文中使用的术语“自组装”所指的是在通常环境条件下原子、分子或多肽形成的 具有正规形状和结构。特别是，自组装是指肽聚集成一个有序的结构。术语“自组装多肽”，是指本文中所使用的肽能与另一具有相同或不同的氨基酸序 列的肽非共价相互作用，进而在近热力学平衡条件下形成一个有序的结构。本文中所使用术语“氢键”，是一种化学键，其中一个分子的氢原子被吸引到通常 是另一个分子的具有电负性的原子上，尤其是氮或氧原子。氢键发生于多肽上的氨基酸之 间，尤其是多肽骨架的氨基酸上的原子之间易形成氢键作用力。但是，氨基酸侧链上的原子 形成的氢键更有助于稳定和诱导肽组装。短链肽的侧链相互作用更为重要。本文中所使用的术语“ β链”，是指采用伸展构象和涉及氢键的氨基酸的一个连续 展开的结构。这“β-折叠”这个术语是指可相互形成氢键的β链的聚集。β链间呈平行或反 平行排列，从而形成β-折叠(片层)。测定其平行或反平行构象是基于肽从N至C端排列 的方向。平行排列是指所有肽都是从N到C端方向排列。反平行排列是指，交替肽是相反 的方向排列(即第一个肽是从N到C端排列，而相对的第二肽是从C至N端排列)。平行排 列可以包含肽平移造成的肽两端彼此交错。至少肽的一半长度涉及肽间相互作用力。在反 平行的排列中，多肽通常是排列成一条线来提供平齐的两个端点。这是一个典型的终端到 终端互补肽。本文中所使用的术语“离子互补性”是指带正负电荷的残基交替排列这个特殊模 式的特征。典型的电荷分布是第一类(_+)；第二类型(一++)；第四类型(一一++++)，和重 复此类电荷分布或其组合的其它任意类型。本文中所使用的术语“疏水性的”是指一种物质倾向于排斥水，或者是完全不能在 水中溶解。本文中所使用的术语“亲水性的”，是指能很容易吸收水分并具有很强的易与水相 互作用的极性基团的特性。本文中所使用的术语“两亲性的”是指一种物质既有疏水性又有亲水性。两亲性 肽包含极性、水溶性(亲水性的)和非极性、不溶于水(疏水性的)的碳氢链氨基酸，这些 氨基酸排列成一个特定的序列，可让肽分子有截然不同的亲水区和疏水区。本文中所使用的术语“功能基团”指的是一个额外的短肽序列，此序列可赋予肽某 些特殊生物活性，并能与其它分子/材料结合。功能基团的例子包含分子和细胞识别序列， 穿透细胞膜的序列，和能与金属离子结合的基序。功能性基团授予多肽特定的功能，但他们 并不一定会促进肽自组装。
本文中所使用的术语“细胞靶向基团”是指可以选择性地与特定的细胞作用的短 肽序列。靶向基团能够结合到细胞表面，倾向于形成一对结合体，例如抗体或其部分片段 (如单链，Fab片段)，或一个受体配体。在另一优选实施例，靶向基团包含一个低分子量蛋 白质，例如但不仅限于，溶菌酶。细胞靶向基团不参与肽自组装。本文中所使用的术语“纳米结构”是指各部分排列成具有纳米尺寸的一种结构。 纳米结构可以形成任何一维，二维，或三维空间的任何形状，包含纳米薄膜，纳米纤维，纳米 棒，纳米线，纳米纤维网络，纳米球，纳米螺旋线及其几种的混合物。具有纳米构造的表面具 有纳米级的一维结构，即物体的表面厚度只有为0. Inm到IOOnm之间。纳米管具有纳米尺 寸的两个维数，即该管的直径为0. 1至lOOnm，其长度可能更大。最后，球形纳米粒子在纳米 尺寸上有三个维数，即粒子纳米在每个空间维度上的尺寸为0. 1至100纳米。本文中所使用的术语“寡核苷酸”是指由30或更少的核苷酸组成的一个分子。本 术语包含脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，修饰过的或未经修饰的。核糖核酸可能 的形式为小核RNA (snRNA)，小RNA (miRNA)，核糖体RNA (rRNA)，信使核糖核酸(mRNA)，反义 RNA (antisense RNA)，短发夹RNA (shRNA)，小干扰RNA (siRNA)，和核酶。寡核苷酸可能是单 链或双链。本文中所使用的术语“生物传感器”，是指一个能够检测，记录，并传输有关生理变 化或过程信息的器件。更详细的说，生物传感器使用由分离出来的酶，免疫系统，组织，细胞 器或整个细胞介导的特定生化反应来检测化合物，通常是使用电，热或光信号。本文中所使用的术语“燃料电池”是指一个在生物催化剂，酶，细胞或整个细胞有 机体存在条件下可将原料转换成电力的设备。更详细的说，像自组装多肽这样的生物材料， 通过为酶固定化提供生物兼容性的环境来改善燃料底物和氧化剂与电极间的电子转移来 参与生物燃料的制备。指本文中所使用的术语“治疗剂”是指任何用于治疗一种疾病或适应症的化合物 或成分，包含，而不限于注，药物，小蛋白分子和寡核苷酸。适当的治疗剂包含但不仅限于， 包含抗癌药物紫杉醇，玫瑰树碱，喜树碱，阿霉素和以阿霉素和寡核苷酸为基础的试剂。定 义中包含疏水性和亲水性药剂。本文中所使用的术语“稳定剂”是指那些可以放入肽-药物复合物中以提高复合 物在体内稳定性的材料。在本领域中，一个稳定剂的选择需要避免与其它任意成分有害反 应的相互作用，降低活性药剂的溶解度。本发明使用的稳定剂的实例包含甘油，聚乙二醇 (PEG)，丙二醇，脂肪酸，Labrasol (R)，Capmul MCM(R)，Captex200 (R)，Captex 300 (R)或其 混合物。本文中所使用的术语“药物辅料”，是指作为一种药物的有效成分载体的无效物 质。不受限于此，药物辅料可适当从下面的一种或任何几种物质的组合选择葡萄糖，山梨 醇，甘露醇，淀粉，糊精，麦芽糊精，乳糖，硬脂酸镁，硬脂酸钙，滑石粉，微晶纤维素，羟丙基 甲基纤维素和羟乙基。也可以使用其它合适的辅料。本文中所使用的术语“生物催化剂”，是指催化氧化/还原反应的酶。本文中所使用的术语“电极”，是指可传递电子到还原/氧化反应中心或从还原/ 氧化反应中心传递电子的导电材料。本文中所使用的术语“电子转移中间体”，是指一个可从电化学反应中心到电极间帮助转移电子一种分子。本文中所使用的术语“燃料来源”是指可以进行氧化/还原反应生成电流的材料。基于氨基酸配对特性设计的自组装多肽可能用来形成多种多样的纳米结构。本发 明通过一个氨基酸配对(AAP)的方法设计自组装肽是基于氨基酸可形成彼此相互作用力 的能力，此作用力至少是下面作用力的一种离子互补性，氢键，疏水性和范德华相互作用 力(图1)。以氨基酸配对为基础的设计的多肽提供了可达到一定的立体化学和物理化学稳 定性的互补作用力，产生的配对亲和力和最小配对自由能。例如，天门冬酰胺-天门冬酰胺 (asn-asn或N-N)可形成一个氨基酸对，并可被采用到多肽序列中，这是因为天门冬酰胺既 可作为质子供体又可作为质子受体来参与氢键相互作用。当自组装多肽彼此靠近，互补氨 基酸进行配对，纳米结构就可形成，一般情况下形成反平行或平行式β "折叠的二级结构。在20种必需的氨基酸中，有13种已被确定为能通过相应的侧链来形成氢键。这 些氨基酸可作为质子受体的包含精氨酸，色氨酸，酪氨酸，赖氨酸，组氨酸，天门冬氨酸，苏 氨酸，半胱氨酸，丝氨酸，天门冬酰胺，谷氨酸，蛋氨酸和谷氨酰胺。除蛋氨酸外，所有这些氨 基酸还可充当质子供体。根据质子供体和质子受体在氨基酸上的位置可确认氨基酸结合 对。氨基酸结合对还可进一步界定为易溶性和不易溶性。在3-位置可作为质子受体，形成 氢键，并具有较高水溶性的氨基酸是天门冬氨酸和组氨酸。天门冬氨酸能够与在3-位置的 质子供体氨基酸丝氨酸结合形成氢键，而组氨酸能够与苏氨酸氢键结合。同样，4-位置质子 受体氨基酸色氨酸、组氨酸和天冬氨酸与4-位置质子供体氨基酸谷氨酰胺酸氢键结合，而 精氨酸，谷氨酸与4-位置的质子供体氨基酸天门冬酰胺氢键结合。5-位置质子受体氨基 酸酪氨酸可与相应的质子供体氨基酸谷氨酸和精氨酸氢键结合，而赖氨酸可与谷氨酰胺， 色氨酸和组氨酸氢键结合。具有较低水溶性的氢键结合氨基酸对包含天门冬酰胺(3-位 置质子受体)与苏氨酸、丝氨酸或半胱氨酸；蛋氨酸(3-位置质子受体)与半胱氨酸和丝氨 酸；4-位置质子受体氨基酸谷氨酰胺与天冬酰胺；和5-位置质子受体酪氨酸与谷氨酰胺或 色氨酸，如表-4所示。含有2至8个氨基酸长度(1至4个氨基酸对)可溶性较低的氢键氨基酸对的肽可 以被合成。典型的肽由以下氨基酸组成谷氨酰胺(Q)-天冬酰胺(N)或天冬酰胺(N)-丝 氨酸(S)氨基酸对。多肽的N端点可能会被乙酰保护，C端点可能被氨基保护。肽可能含 有不同数量的氨基酸，以及不同数量的连续氢键对。例如，我们可以合成含有单对氢键对的 多肽(例如QN，NS)的，还可以合成具有双对氢键对的肽(例如QNQN合NSNS或QQNN)，还 可以合成含四对氢键对的肽(例如NSNSNSNS)。肽除了只含有可形成氢键对的氨基酸，肽还可以含能参与所有的离子配对，疏水 配对，和氢键配对的氨基酸。并且这样的肽也可以被合成。疏水、亲水性氨基酸残基交替排 列有助于肽形成两亲性。在一个实施例中，本发明提供了一种用于生产纳米结构的具有氨基酸配对特性的 自组装氨基酸肽的制备方法。该方法包含下列步骤设计链肽，其所含氨基酸与其互补 氨基酸至少能够形成下列作用力的一种氢键，静电相互作用，疏水相互作用和范德华作用 力；此类多肽链含有2至40个氨基酸，含有至少一个氨基酸对能够形成至少一种下列作用 力，氢键，静电相互作用，疏水相互作用，以及范德华作用力，并具有互补性氨基酸配对并立 体互补于第二个多肽。
傅里叶变换红外光谱(FTIR)，圆二色谱(⑶)和硫磺素T(ThT)荧光光谱可用于分 析肽的二级结构。红外光谱可以有助于描述肽形成β-折叠的能力，同时ThT荧光分析可 以用来说明肽聚集物是否含有丰富的β-折叠结构。在一个实施例中，本发明提供了 一种自我互补β _链肽具有交替氢键质子供体氨 基酸片段和氢键质子受体的氨基酸片段，可以自我组装成纳米结构。此类多肽含有2至40 个氨基酸长度。此类多肽至少含有一个质子供体和一个质子受体片段，每个片段至少含有 一个氨基酸。此种肽不是由交替的疏水性和亲水氨基酸片段组成。在一个实施例中，本发明中的β-链肽还可进一步包含至少一个功能基团，此功 能基团位于肽的N端和C端的至少一个端点上。在一个实施例中，功能基团可以是细胞靶 向基团、金属离子结合基序、或细胞膜穿透基团。在一个实施例中，本发明的氢键存在于肽上具有互补性的氨基酸对的侧链之间。 在一个实施例中，互补肽组装成一个平行构象。在一个实施例中，互补肽组装成反平行构 象。多肽可通过端到端式或交错式自组装排列。在一个实施例中，本发明的肽可以组装成 交错的排列，其中有1至20个氨基酸与第二个多肽的氨基酸形成互补氢键。在一个实施例中，本发明的β _链肽上的氢键质子供体氨基酸是选自下列氨基酸 组精氨酸，色氨酸，酪氨酸，赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，丝氨酸，天门冬 酰胺，谷氨酸和谷氨酰胺。在一个实施例中，β-链肽上的氢键质子受体氨基酸是选自下 列氨基酸组精氨酸，色氨酸，酪氨酸，赖氨酸，组氨酸，天门冬氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，丝氨 酸，天门冬酰胺，谷氨酸，蛋氨酸，谷氨酰胺。在一个实施例中，本发明提供了自我互补链肽，包含至少一个氢键氨基酸对， 至少一个离子互补氨基酸对，至少一个疏水氨基酸对，并有4至40个氨基酸长度，可形成纳 米结构。在一个实施例中，这种肽符合下列结构式(AwBxAyCz)nAaBb(V)其中，Α，Β和C均为氨基酸，是从下列组中选出，疏水氨基酸组，带电氨基酸组和氢 键氨基酸组，并且Α，B和C是彼此不同的氨基酸；w，X，y和ζ是均为从1到5的整数，A和 B是一个从0到2的整数，并且η是一个从1到10整数。疏水氨基酸可适当地选自缬氨酸， 异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，半胱氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，苏氨酸， 丝氨酸，脯氨酸，甘氨酸，精氨酸和赖氨酸氨基酸组。带电氨基酸可适当地选自组氨酸，精氨 酸，赖氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸氨基酸组。在一个实施例中，本发明包含氨基酸序列，苯丙氨酸_谷氨酸_苯丙氨酸_谷氨 酰胺_苯丙氨酸_天门冬酰胺_苯丙氨酸_赖氨酸(Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-Asn-Phe-Lys， AC8) (SEQ ID NO :6)。这项发明还包含这种肽自组装形成的纳米结构。在一个实施例中，本发明提供了一种自我互补链肽，具有下列结构之一a) (AxByCz)wAz(I)，和b) (AxByCz)w(C' XB' yA' z)w (II)A, A' ,B,B'，C和C'，为可形成氢键的氨基酸，可以是质子供体或质子受体氨基 酸；X和y为从1到10的整数，；Z是从0到10的一个整数；W是从1至20的一个整数。A 可互补于A'，B可互补于B'，C可互补于C'。在一个实施例中，本发明所提供的自我互补型链肽还可具有下列结构之
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a)AxByCz- ；(III)，和b) AxByCz... C' XB' yA' z (IV).A, A' ,B, B'，C和C'是一个独立氨基酸供体或受体，而且相同字母的氨基酸具 有互补性。这些氨基酸可从下列组中选出氢键供体氨基酸组，氢键受体氨基酸组，带正电 的氨基酸组，带负电荷的氨基酸组，可范德华相互作用的氨基酸组。A可互补作用于A'，B 可互补作用于B'，C可互补作用于C'。在一个实施例中，本发明提供了一种自我互补β-链肽，此β-链肽含有至少一个 氢键氨基酸对，至少一个离子互补氨基酸对，至少一个疏水氨基酸对，并且此β “链肽可形 成纳米结构。此种多肽含有4至40个氨基酸。本发明的自我互补β-链肽包含谷氨酰胺-天门冬酰胺(Gln-Asn)，谷氨酰胺-天 门冬酰胺-谷氨酰胺-天门冬酰胺(Gln-Asn-Gln-Asn，SEQ ID NO 1)，谷氨酰胺-谷氨酰 胺-天门冬酰胺-天门冬酰胺(Gln-Gln-Asn-Asn, SEQ ID NO :2)，天门冬酰胺-丝氨酸 (Asn-Ser)，天门冬酰胺_丝氨酸-天门冬酰胺_丝氨酸(Asn-Ser-Asn-Ser, SEQ ID NO 3)，天门冬酰胺-丝氨酸-天门冬酰胺_丝氨酸-天门冬酰胺(Asn-Ser-Asn-Ser-Asn，SEQ ID NO 4)和天门冬酰胺-丝氨酸-天门冬酰胺_丝氨酸_天门冬酰胺_丝氨酸_天门冬 酰胺-丝氨酸(Asn-Ser-Asn-Ser-Asn-Ser-Asn-Ser，SEQ ID NO :5)。这项发明还包含这些 多肽形成的纳米结构。本发明的多肽可用于制备各种形式的纳米结构，包含纳米纤维、纳米纤维网络、纳 米管、纳米线、纳米球和纳米螺旋线，以及这些结构的组合。多肽在其临界聚集浓度(CAC) 可组装成与浓度相关的不同纳米结构。当多肽浓度低于临界聚集浓度时，肽可以形成一 个单层细小的原细纤维和多肽单体的混合物，而当多肽浓度高于其临界聚集浓度时，多 肽可能形成成熟的纤维和纤维束，或其它纳米结构。由肽聚集形成的纳米结构取决于肽 在溶液中的浓度，以及溶液的 pH(reviewed in Chen (2005) Colloids and Surfaces A Physiochem. Eng. Aspects 26 :3_24.)多肽的临界聚集浓度可通过ThT荧光测定法，表面张 力测定法，ANS荧光分析法和稳态光散射实验来确定。在一个实施例中，本发明提供了一种自组装形成的纳米结构，此纳米结构是由符 合下列结构式的一个肽聚集而形成a) (AxByCz)wI ；和b) (AxByCz)wAx II.A，B, C均由可提供质子供体和受体而形成氢键的氨基酸组成；χ和y是从1到10 的一个整数，ζ是从0到10的一个整数；w是从1至20的一个整数。此类自组装肽形成以 下的几种纳米结构的一种纳米纤维，纳米线，纳米薄膜和纳米球。在一个实施例中，本发明提供了一种自组装形成的纳米结构，此纳米结构是由符 合下列结构式的肽聚集而形成(AwBxAyCz)nAaBb(V).A，B和C均为氨基酸，从下列组中选出，疏水氨基酸组，带电氨基酸组和氢键氨基 酸组，并且A，B和C是彼此不同的氨基酸；w，X，y和ζ每个是从1到5的整数，A和B是一 个从0到2的整数，并且η是一个从1到10整数。此类自组装多肽形成下列纳米结构的一种纳米纤维，纳米线，纳米薄膜和纳米球。本发明的多肽可用于可控释放药物递送方面。在此之前，EAK16肽被证明可 用于包裹高度疏水性化合物芘，(图 2，Keyes-Bag etal. (2004) J. Am. Chern. Soc. 126 7522-7532)。研究进一步表明，芘对肽的比率导致不同的表面包覆(图3)。目前本发明公 开的肽可用于溶解疏水性治疗药物，如抗癌药物玫瑰树碱(玫瑰树碱具有质子化和非质子 化的中性两种形式)。此外，此类肽在药物递送工具方面有较好的应用价值。被新设计的肽 溶解的中性玫瑰树碱，在经过水稀释16倍后，在肽内部被保护的仍然很好，并且具有较好 的稳定性。该肽也可用于基因和寡核苷酸递送的应用。本发明还发现EAK 16-I,EFKI6-II 和EAK16-II可用于溶解疏水治疗药物、基因和寡核苷酸递送的应用。本发明的药物组成成分可包含公开的肽和任何适合的在本领域已知的赋形剂或 稳定剂。进一步的说，本发明的治疗剂和药物组合物的给药方式，不特别限制于在此领域已 知的合适的给药方式，包含但不限于口服和静脉注射。在一个具体的实施例中，本发明提供了可给病人递送治疗剂的一个试剂盒，该试 剂盒包含药物组合物，该组合物包含自组装β-链肽与治疗剂；一个或几个电解质，缓冲 液，给药工具，可把各种成份混合到一起的容器，使用时制备药品的说明书，混合该组合物 和其它成分的说明书，和将此组合物给予受试者的说明书。本发明的肽可在不同的表面上组装，此表面可以是疏水性的也可以是亲水性的。 已经证明，β-淀粉样肽(氨基酸1-42)能够在不同的表面上组装，这些表面包含云母(亲 水性的)和高定向裂解石墨(疏水性的)(图4 ；Kowalewski and Holtzman(1999)96 3688-3693)。β -淀粉样聚集物的大小和形状，以及它们形成的动力学，均表现出依赖于表 面的物理化学性质。两亲性肽可被种到带电的亲水性的表面，如云母，可进一步延长形成纳 米纤维，此过程是浓度依赖的方式(图5和6)。两亲性肽沉积到带电表面的驱动力主要是 静电相互作用(“肽-表面相互作用”)。这样，肽更容易将其两端和“种子”对齐，以实现纳 米纤维的增长。纳米纤维的增长可接下来通过调控溶液的PH值来对照，其原理如图7所示。 同样的肽也可种在一个疏水表面上，如高定向热解石墨表面，并组装成不同的纳米结构。例 如，ΕΑΚ16肽彼此排列成60°和120°角度。因此，本发明的肽，可形成特殊纳米结构，此纳 米结构取决于其所种的表面的性质。肽的表面改性会导致表面润湿性的变化。肽修饰的表 面，可用于生物分子传感应用。肽可结合生物分子，如酶，进而用于酶底物传感，并将生物分 子固定在表面上。在一个具体的实施例中，本发明提供了 一种燃料电池。在本发明的肽具有在不同的表面上组装而制作生物活性电极的能力，使其在生物 燃料电池方面有用。生物燃料电池是使用生物催化剂，通过电化学方法，从燃料来源生产电 的一种装置。本发明的肽能固定在电极上，从而用来进一步固定生物传感分子如酶。可以 添加酶底物以驱动催化反应。这种生物燃料电池具有较好的存储和操作稳定性。在一个具体的实施例中，本发明提供了一种链肽在鉴定蛋白质聚集疾病的抑 制剂方面的应用。本发明的肽可用于产生研究蛋白质构象疾病的模型，如老年痴呆症和朊病毒疾 病。本发明的肽与淀粉样肽(1-42氨基酸)相类似，可被接种到各种表面上，从而研究 其组装的机理以及抑制其组装的方法。
本发明的多肽可应用于蛋白质组学和生物信息学应用。分子动力学模拟可以用来 筛选潜在的具有互补性，可以相互作用的氨基酸对。此信息对肽文库的发展是非常有用的。 具体应用包含用于生产蛋白/多肽和DNA阵列的高通量的筛选和鉴定研究。肽可用于修饰 阵列表面，其功能性残基可用于固定DNA和蛋白质分子到阵列上。在一个具体的实施例中，本发明提供了一种检测目标生物分子的方法。该方法包 含下列步骤肽自组装从链肽形成纳米结构；肽吸附到电极表面，允许电子转移和生物 催化剂的固定；偶联一个可提供肽包裹的纳米结构表面可测信号的“报道”分子；提供目标 生物分子。在一个具体的实施例中，但不仅限于此，生物分子可选自蛋白质，核酸，碳水化合 物和病毒。在一个具体的实施例中，目标生物分子是葡萄糖。本发明的肽，可用于各种涂层应用，包含防止生物附着的涂层；提高生物兼容性 的表面涂层；和功能化色谱柱的涂层。肽还可用于修饰表面涂层，并为蛋白质/酶的固定提 供一个生物兼容性的环境。肽的序列决定其二级结构和自组装肽聚集的纳米结构，并影响其在药物递送、化 学传感、生物燃料电池和蛋白质聚集疾病研究模型方面的应用。本发明的优点在以下实施例中得以进一步的说明。下面提到的例子和它们具体细 节均仅为说明本发明，不应被解释为限制本发明的权利要求。实施例1 氢键氨基酸配对(AAP)表1列出可形成氢键的氨基酸，以及其可作为质子供体和质子受体的原子位置。 能够配对的氨基酸列于表2。可溶的和较不可溶的氢键氨基酸配对分别列于表3和4。当 氨基酸带有电荷时，排斥力的存在会抑制氢键配对(见表3)。因此，不带电荷的氨基酸对能 形成氢键是特别兴趣的。表1.形成氢键的氨基酸及其氨基酸中可作为受体和供体的原子位置。
权利要求
一种自互补的β链肽，包含交替的氢键质子供体氨基酸片段和氢键质子受体氨基酸片段，并且具有至少二至四十个氢键氨基酸的长度以形成纳米结构，其中a)所述氢键质子供体氨基酸片断由至少一个氨基酸组成；b)所述氢键质子受体氨基酸片断由至少一个氨基酸组成；c)所述β 链肽包含至少一个质子供体片断和至少一个质子受体片断；并且d)所述肽不是由交替的疏水性和亲水性氨基酸片段组成，其中，自互补的β 链肽组装成所述纳米结构。
2.根据权利要求1所述的自互补链肽，其中，氢键形成于互补性氨基酸的侧链之间。
3.根据权利要求1所述的自互补链肽，其中，自互补的肽以一种平行或反平行的构象组装。
4.根据权利要求3所述的自互补β-链肽，其中，所述肽可进一步以一种端点对端点或 交错肽排列的方式组装。
5.根据权利要求4所述的自互补链肽，其中，所述肽以交错排列的方式组装，并且 在所述肽中有至少1个到至少20个氨基酸与第二个肽的互补氨基酸形成氢键。
6.根据权利要求1所述的自互补链肽，其中，所述氢键质子供体氨基酸选自下列氨 基酸Arg、Trpλ TyrΛ LysΛ His、Asp、Thr、CysΛ Ser、Asn、Glu 和 Gin。
7.根据权利要求1所述的自互补链肽，其中，所述氢键质子受体氨基酸选自下列氨 基酸Arg、Trp> Tyr> Lys> His、Asp、Thr、Cys> Ser、Asn、Glu、Met 禾口 Gin。
8.根据权利要求1所述的自互补β-链肽，其中，所述纳米结构选自纳米纤维、纳米管、 纳米平面和纳米球。
9.根据权利要求1所述的自互补链肽，其中，至少一个氢键氨基酸是不带电荷的。
10.根据权利要求1所述的自互补链肽，具有选自以下的结构a)(AxByCz)人(I)；和b)(AxByCz)w(C' XB' yA' z)w(II)其中，A、A'、B、B'、(和('每个均选自质子供体和质子受体； χ和y每个独立地是1到10的整数； ζ是0到10整数；并且 w是1到20的整数；其中A与A'互补，B与B'互补，C与C'互补。
11.根据权利要求1所述的自互补链肽，具有选自以下的结构a)AxByCz-· · ；(III)，和b)AxByCz. . . Cz' By' Ax'(IV)，A、A'、B、B'、(和('每个独立地是供体氨基酸或受体氨基酸，而且每个自互补，选 自氢键供体氨基酸、氢键受体氨基酸、带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸、和范德华相 互作用的氨基酸，并且其中，A与A'互补，B与B'互补，C与C'互补。
12.根据权利要求1所述的自互补β_链肽，选自以下序列=Gln-Asru Gln-Asn-Gln-Asn (SEQ ID NO1), Gln-Gln-Asn-Asn(SEQ ID NO 2)、Asn-Ser、Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO 3),Asn-Ser-Asn-Ser-Asn(SEQ ID NO 4)和 Asn—Ser—Asn—S er-Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO :5)。
13.根据权利要求1所述的自互补链肽，进一步在所述肽的N端和C端中的至少一 个含有功能基团，其中，所述功能基团选自细胞靶向部分、金属离子结合基序、和细胞膜穿 透部分。
14.根据权利要求1所述肽，其中，所述氨基酸选自天然氨基酸，D型氨基酸，β-氨基 酸衍生物和Y氨基酸衍生物。
15.一种自互补β-链肽，包含至少一个氢键氨基酸对，至少一个离子互补氨基酸对， 和至少一个疏水氨基酸对，并具有4至40个氨基酸的长度以形成纳米结构。
16.根据权利要求15所述的自互补β-链肽，其中，所述自互补肽以一个平行或反平行 的构象组装。
17.根据权利要求15所述肽，具有以下通式 (AwBxAyCz)人Bb (V)其中，Α、Β和C每个均是选自疏水氨基酸、带电荷的氨基酸、和氢键氨基酸，并且Α、Β和 C彼此不同；w、χ、y和ζ每个独立地是从1到5的整数； a和b每个独立地是从0到2的整数；并且 η是从1到10整数。
18.根据权利要求15所述肽，其中，所述疏水氨基酸选自Val、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、 Cys、Ala、Tyr> His、Thr> Ser> Pro、Gly、Arg 禾口 Lys0
19.根据权利要求15所述肽，其中，所述带电荷的氨基酸选自HiS、Arg、Lys、Asp和Glu0
20.根据权利要求15所述肽，其中，所述氢键氨基酸选自质子供体和质子受体。
21.根据权利要求15所述肽，进一步包含至少一个π键配对氨基酸，选自Tyr、Phe和Trp0
22.根据权利要求15所述肽，由以下氨基酸序列组成=Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-Asn-Phe -Lys(AC8)(SEQ ID NO :6)。
23.根据权利要求15所述肽，其中氨基酸A、B和C为独立的自互补氨基酸和独立的与 非自身氨基酸互补的氨基酸，并且所述肽自组装成平行的β _折叠。
24.根据权利要求15所述肽，其中，Α、Β和C每个分别与第二个肽中的氨基酸互补，但 不是分别与Α，B和C互补，并且所述肽自组装成反平行β _折叠。
25.一种自组装的纳米结构，由具有选自以下结构的肽的聚集单位组成a)(AxByCz)wI ；和b)(AxByCz)wAxII其中，A、B和C每个均为选自质子供体和质子受体的氢键氨基酸； χ和y每个独立地是从1到10的整数； Z是从0到10的整数；并且 w是从1到20的整数，其中，纳米结构选自纳米纤维、纳米线、纳米薄膜和纳米球。
26.根据权利要求25所述的自组装纳米结构，其中所述肽选自=Gln-Asru Gln-Asn-Gln-Asn(SEQ ID NO 1) , Gln-Gln-Asn-Asn(SEQ ID NO :2)、Asn-Ser、 Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO 3),Asn-Ser-Asn-Ser-Asn(SEQ ID NO 4)和 Asn—Ser—Asn—S er-Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO :5)。
27.一种自组装纳米结构，由具有通式(V)的肽的聚集单位组成 (AwBxAyCz)人Bb(V)其中，A、B和C每个均选自疏水氨基酸、带电荷的氨基酸和氢键氨基酸，并且A、B和C 是彼此不同的；w、χ、y和ζ每个独立地是从1到5的整数； a和b每个独立地是从0到2的整数；并且 η是从1到10的整数，其中，所述纳米结构选自纳米纤维、纳米线、纳米薄膜和纳米球。
28.根据权利要求27所述的自组装纳米结构，其中，所述肽是Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-A sn-Phe-Lys(SEQ ID NO :6)。
29.一种药物组合物，包含权利要求15所述肽和治疗剂。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，进一步包含药学上可接受的赋形剂。
31.根据权利要求29所述的药物组合物，进一步包含稳定剂。
32.根据权利要求29所述的药物组合物，其中，所述肽是Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-Asn-P he-Lys(SEQ ID NO 6)。
33.根据权利要求29所述的药物组合物，其中，所述治疗剂选自药物、小蛋白分子、寡 核苷酸、siRNA, miRNA 和 shRNA。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中，所述治疗剂是疏水性药物。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中，所述治疗剂为选自紫杉醇、玫瑰树碱、 喜树碱、阿霉素和亚德里亚霉素的抗癌剂。
36.根据权利要求33所述的药物组合物，其中，所述治疗剂是亲水性的。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中，所述治疗剂是寡核苷酸。
38.一种药物组合物，包含权利要求1所述肽和治疗剂。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，进一步包含药学上可接受的赋形剂。
40.根据权利要求38所述的药物组合物，进一步包含稳定剂。
41.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述肽选自=Gln-Asru Gln-Asn-Gln-Asn(SEQ ID NO 1) , Gln-Gln-Asn-Asn(SEQ ID NO :2)、Asn-Ser、 Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO 3),Asn-Ser-Asn-Ser-Asn(SEQ ID NO 4)和 Asn—Ser—Asn—S er-Asn-Ser-Asn-Ser(SEQ ID NO :5)。
42.一种给病人递送材料的试剂盒，包含权利要求27和36中任一项所述的药物组合物；和一种或多种电解质、缓冲液、递送装置、适合把一种或多种其它药剂混合到一起的容 器；和为使用配制所述药物组合物的说明书，混合所述组合物和其它药剂的说明书，和将所 述组合物给予受试者的说明书。
43.一种制备形成纳米结构的具有氨基酸配对性质的自组装肽的方法，包含a)设计一种肽，所述肽由能够与互补氨基酸形成氢键、静电相互作用、疏水相互作用和 范德华力相互作用中的至少一种的氨基酸组成；并且b)产生2至40个氨基酸长度的肽，所述肽由能够形成氢键、静电相互作用、疏水性相互 作用和范德华力相互作用中的至少一种的氨基酸对组成，并与第二个肽形成互补的氨基酸 配对和互补的立体化学。
44.根据权利要求15所述肽在给细胞递送治疗剂中的应用。
45.根据权利要求44所述的应用，其中所述治疗剂是疏水性的。
46.根据权利要求44所述的应用，其中所述治疗剂是亲水性的。
47.根据权利要求44所述的应用，其中所述治疗剂是寡核苷酸。
48.一种检测目标生物分子的方法，包含a)由权利要求1所述肽自组装形成纳米结构；b)将所述肽吸附到电极表面，以允许电子转移和生物催化剂的固定；c)偶联报告分子，所述报告分子能够给所述肽修饰的纳米结构表面提供可检测的信 号；以及d)提供所述目标生物分子。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述肽选自EAKI6-I，EFK16-II和EAK16-II。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述目标生物分子选自蛋白质，核酸，碳水化合 物和病毒。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述目标生物分子是葡萄糖。
52.一种检测目标生物分子的方法，包含a)由权利要求15所述肽自组装形成纳米结构；b)将所述肽吸附到电极表面，以允许电子转移和生物催化剂的固定；c)偶联报告分子，所述报告分子能够给所述肽修饰的纳米结构表面提供可检测的信 号；以及d)提供所述目标生物分子。
53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述肽是Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-Arg-Phe-Lys。
54.根据权利要求52所述的方法，其中，所述目标生物分子选自蛋白质、核酸、碳水化 合物和病毒。
55.根据权利要求52所述的方法，其中，所述目标生物分子是葡萄糖。
56.根据权利要求1所述肽在形成生物燃料电池中的应用。
57.根据权利要求56所述的应用，其中，所述的生物燃料电池进一步包含电极、生物催 化剂、燃料源和膜。
58.根据权利要求56所述的应用，其中，所述肽选自EAKI6-II和ΕΠ(Ι6-ΙΙ。
59.根据权利要求15所述肽在形成生物燃料电池中的应用。
60.根据权利要求59所述的应用，其中，所述生物燃料电池进一步包含电极、生物催化 剂、燃料源和隔膜。
61.根据权利要求59所述的应用，其中，所述肽是Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-Arg-Phe-Lys。
62.根据权利要求1所述肽在鉴定蛋白质聚集疾病的抑制剂中的应用。
63.根据权利要求1所述肽在改变表面的润湿性中的应用。
64.根据权利要求1所述肽在改变表面的生物相容性中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于形成纳米结构的自组装β-肽链，包含该肽的组合物和形成该肽的方法。此外，本发明还涉及这些肽在药物递送和增加药物的溶解度、生物分子检测及生物催化应用中的用途。本发明的多肽还可用于蛋白质聚集疾病的模型中。
文档编号H01M8/22GK101939329SQ200880114082
公开日2011年1月5日 申请日期2008年8月29日 优先权日2007年8月30日
发明者冯善宇, 杨红, 陈璞 申请人:滑铁卢大学