刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型及构建方法及应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型及构建方法及应用，构建方法包括如下步骤：根据KEGG及NCBI数据库中刺糖多孢菌基因组序列的注释信息，添加多杀菌素生物合成的特征反应和菌体合成反应，并对网络反应进行手动精炼，获得刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型。本发明利用刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型，预测潜在基因靶点对多杀菌素产量提高的影响，最终确定改造方向，实现菌株的途径分子改造方法。实验证明，利用本发明的刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型预测的基因，经改造得到的基因工程菌能使多杀菌素产量比野生型菌株提高了86.5%。为以后多杀菌素高效生产合成菌株的构建、研究和分析提供了指导平台。
【专利说明】刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型及构建方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物菌株代谢工程分子改造【技术领域】，特别涉及刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型及构建方法及应用。
技术背景
[0002]多杀菌素是一种大环内酯类抗生素，由刺糖多孢菌经有氧发酵产生。由于多杀菌素独特的化学结构和作用机制，它可以有效防治小菜蛾、甜菜夜蛾等多种鳞翅目害虫，同时对哺乳动物、鸟类等没有毒性(ACS symposium series.Discovery, isolation, andstructure elucidation of a family of structurally unique, fermentation-derivedtetracyclic macrolides.1992)。多杀菌素也因此被认为是继阿维菌素之后最为有效的生物杀虫剂，成为新型生物农药研发的热点。由于该化合物兼具化学农药的速效性和生物农药的安全性、低残留等优点，继1999获得美国“总统绿色化学品挑战奖”后，2008年其衍生物再一次获得该奖(The Journal of antibiotics.The spinosyn family ofinsecticides!realizing the potential of natural products research.2010)。
[0003]由于野生型菌刺糖多孢菌菌株产多杀菌素能力弱，因此自其被发现以来，科学家采取多种手段对原始菌株进行改良。目前，研究人员对多杀菌素发酵单位提高所做的努力主要集中在传统的理化性质诱变，利用基因工程手段对多杀菌素合成途径基因进行局部敲除或过表达改造。多杀菌素作为刺糖多孢菌的一种次级代谢物，其合成途径复杂，局部水平的改造具有一定的盲目性，而且其改造结果也难以满足生产需求。
[0004]近几年内，随着高通量测序技术的发展，测序成本的降低，越来越多的物种全基因组被测序。如何利用如此庞大的基因组数据成为人们的研究热点。基因组尺度网络模型，以基因组注释信息为基础，提供了一个在整体水平上考察细胞代谢的理想视角(Currentopinion in biotechnology.Recent advances in reconstruction and applications ofgenome-scale metabolic models.2011)。基因组尺度网络模型可以从整体上反应系统对外界扰动的反应，揭示与该扰动相关的`机理，确定不同表型的潜在原因，是系统生物学研究的重要工具。鲁棒性分析作为一种分析方法，它能反映目标反应对某特定反应的敏感性。
[0005]胞内还原力水平对次级代谢物合成具有重要影响，NADPH的再生水平是限制生物转化效率关键因素，目前，增加胞内NADPH水平主要通过以下三条途:磷酸戊糖途径；三羧酸循环途径；转氢酶途径。对转氢酶的改造，可以调节胞内辅因子的平衡，提高目标产物的产量。在大肠中过表达pntAB，可以使苯乙酮到(R)-苯基乙醇I的转化效率提高3.5倍(Biotechnology letters.1mproved synthesis of chiral alcohols with Escherichiacoli cells co-expressing pyridine nucleotide transhydrogenase, NADP.-dependent alcohol dehydrogenase and NAD+_dependent formate dehydrogenase.2004)在谷氨酸棒状杆菌中过表达PntAB可以显著提高L-1赖氨酸的产量(Applied microbiologyand biotechnology.Expression of the Escherichia coli pntAB genes encodinga membrane-bound transhydrogenase in Corynebacterium glutamicum improvesL-1ysine formation.2007).Bastian(Metabolic engineering.Engineered ketol-acidreductoisomerase and alcohol dehydrogenase enable anaerobic2-methylpropan-l_olproduction at theoretical yield in Escherichia col1.2011)在异丙醇生产过程中通过过表达PntAB解决了辅因子不平衡问题，使异丙醇的产量提高了 6.5倍。
[0006]然而截至目前为止，未见有人报道在刺糖多孢菌中通过改造转氢酶途径实现多杀菌素的闻效生广。
【发明内容】
[0007]本发明的目的提供一种刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型。
[0008]本发明的第二个目的是提供一种刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型的构建方法。
[0009]本发明的第三个目的是提供一种刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型的应用。
[0010]一种刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型的构建方法，包括如下步骤:
[0011]根据KEGG及NCBI数据库中刺糖多孢菌基因组序列的注释信息，添加多杀菌素生物合成的特征反应和菌体合成反应，并对网络反应进行手动精炼，获得刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型。
[0012]上述方法构建的刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型。
[0013]一种刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型在预测与提高多杀菌素产量相关基因靶点的应用。
[0014]上述应用，包括如下步骤:
[0015]I)通过对刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型进行分析，利用鲁棒性分析方法，确定SEQ IDN0.3所示的转氢酶PntAB对多杀菌素生物合成的影响；
[0016]2)根据NCBI上的转氢酶基因序列设计SEQ IDN0.1所示的上游引物和SEQ IDN0.2所示的下游引物，以刺糖多孢菌基因组为模板，PCR扩增转氢酶PntAB基因，利用XbaI和NdeI双酶切，将转氢酶PntAB基因插入到经相同酶切含链霉菌强启动子ermE*质粒p0J260上，得到质粒p0J261(图2)，转化大肠杆菌DH5a，提取质粒后转入大肠杆菌ET12567 (ATCC货号:BAA_525),利用结合转移的方法转入刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)ATCC49460中，以50 μ g/mL的安普霉素筛选得到刺糖多孢菌基因工程菌SP-PNT。
[0017]含链霉菌强启动子ermE*质粒p0J260的构建步骤为:将pIB139质粒用HindIIIand XbaI双酶切，插入质粒p0J260中，获得含链霉菌强启动子ermE*质粒p0J260 ；
[0018]其中pIB139质粒由pSET152(商业化)中插入ermE*强启动子构成，其构建过程参考文献(Journal of molecular microbiology and biotechnology.1ncreasing theefficiency of heterologous promoters in actinomycetes.2002)
[0019]3)将刺糖多孢基因工程菌SP-PNT在发酵培养基中进行发酵，产量比野生型提高，证明转氢酶pntAB基因对多杀菌素生物合成有影响；
[0020]所述发酵培养基配方为:葡萄糖77g/L，棉籽饼粉28g/L，胨化牛奶20g/L，玉米浆膏 14.5g/L，油酸甲酯 40g/L, CaC035g/L,鼠李糖 lg/L，余量为水，pH=7.0。
[0021]本发明的优点:
[0022]本发明利用刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型，预测潜在基因靶点对多杀菌素产量提高的影响，最终确定改造方向，实现菌株的途径分子改造方法。实验证明，利用本发明的刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型预测的基因，经改造得到的基因工程菌能使多杀菌素产量比野生型菌株提高了 86.5%。为以后多杀菌素高效生产合成菌株的构建、研究和分析提供了指导平台。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为转氢酶活性对多杀菌素合成速率的影响。
[0024]图2为转氢酶扩增质粒构建。
[0025]图3为转氢酶扩增质粒验证。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。
[0027]实施例1
[0028]一种刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型的构建方法，包括如下步骤:
[0029]根据KEGG，NCBI数据库中的刺糖多孢菌基因组序列的注释信息，添加多杀菌素生物合成的特征反应(见表1)和菌体合成反应(见表2):
[0030]表1多杀菌素生物合成反应
[0031]
【权利要求】
1.一种刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型的构建方法，其特征包括如下步骤: 根据KEGG及NCBI数据库中刺糖多孢菌基因组序列的注释信息，添加多杀菌素生物合成的特征反应和菌体合成反应，并对网络反应进行手动精炼，获得刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型。
2.权利要求1的方法构建的刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型。
3.一种刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型在预测与提高多杀菌素产量相关基因靶点的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是包括如下步骤: .1)通过对刺糖多孢菌基因组尺度代谢网络模型进行分析，利用鲁棒性分析方法，确定SEQ IDN0.3所示的转氢酶PntAB对多杀菌素生物合成的影响； .2)根据NCBI上的转氢酶基因序列设计SEQIDN0.1所示的上游引物和SEQ IDN0.2所示的下游引物，以刺糖多孢菌基因组为模板，PCR扩增转氢酶pntAB基因，利用XbaI和NdeI双酶切，将转氢酶PntAB基因插入到经相同酶切含链霉菌强启动子ermE*质粒p0J260上，得到质粒P0J261，转化大肠杆菌DH5 a，提取质粒后转入大肠杆菌ET12567，利用结合转移的方法转入刺糖多抱菌(Saccharopolyspora spinosa) ATCC49460中，以50 μ g/mL的安普霉素筛选得到刺糖多孢菌基因工程菌SP-PNT ； 含链霉菌强启动子ermE*质粒p0J260的构建步骤为:将pIB139质粒用HindIII andXbaI双酶切，插入质粒P0J260中，获得含链霉菌强启动子ermE*质粒p0J260 ； 表达载体 pIB139,构建方法参考 J MolMicrobiol Biotechnol4 (4):417-426,由pSET152中插入ermE*强启动子构成。 .3)将刺糖多孢基因工程菌SP-PNT在发酵培养基中进行发酵，产量比野生型提高，证明转氢酶pntAB基因对多杀菌素生物合成有影响； 所述发酵培养基配方为:葡萄糖77g/L，棉籽饼粉28g/L，胨化牛奶20g/L，玉米浆膏14.5g/L，油酸甲酯 40g/L，CaC035g/L，鼠李糖 lg/L，余量为水，ρΗ=7.0。
【文档编号】G06F19/18GK103729576SQ201310756418
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】卢文玉, 王晓阳, 张传波, 薛超友 申请人:天津大学