专利名称：乳中农药残留的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种农药残留的快速检测方法，尤其是涉及一种动物乳与乳制品中农药残留的快速检测方法。
背景技术：
在食品安全日益关注的今天，严格控制产品质量，避免由于药物残留对食品的影响，成为质量控制的关注焦点。然而农药做为食品的重要污染源，由于它的大多数品种用于防治农业有害生物，所以对人体有较大毒害性。进入人体的农药，如果超过了正常人的最大耐受限量，将会导致机体的正常生理功能的失调，引起病理改变和毒性危害，因此食品中农药残留问题也应该得到足够的重视。
在我国乳制品消费量日益增长的趋势下，严格控制乳制品(奶)的质量，对整个乳制品质量安全起到关键的作用。因此，寻找一种灵敏度较好的动物乳中农药残留的快速检测方法对于企业的食品安全性有着重要的意义。
目前，在农药残留快速检测方法的开发中，酶抑制法是研究最多且相对成熟的一种。由于有机磷与氨基甲酸酯化合物为神经系统乙酰胆碱脂酶的不可逆抑制剂，对人具有较高的毒性，酶抑制法是对部分农药进行残留快速检测的技术。有机磷、氨基甲酸酯类农药在总农药用量中占很大比重。有超过100种的有机磷农药在世界范围内应用，中国常用的农药中，甲胺磷、久效磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、氧乐果等高毒农药占总农药用量的一半以上。因此，酶抑制法的农药残留快速测定的应用有极大的现实意义。依据酶抑制设计的农药残留速测技术都是应用于水果蔬菜的农药残留测定，目前还没有应用于基质相对复杂的牛乳中，在此，我们将这些方法开发应用于牛乳的农药残留测定。
发明内容
本发明提供一种乳制品检测领域的一种新方法，具体为乳制品中农药残留的快速检测方法-酶抑制率法，该方法的原理为以碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)为底物，二硫代-二硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂，使样品的提取液与胆碱酯酶作用，经一定时间反应后，根据产生黄色物质的程度，利用酶标仪在420-430nm波长下比色，优选在425nm波长下比色。由吸光值的变化计算胆碱酯酶的抑制率，从而判断有机磷和氨基甲酸酯类农药残留情况。
本发明的检测方法包括如下步骤 1).取检验样品与丙酮混合，振摇，静置10-30分钟，出现上清液即可；在该步骤中，检验样品与丙酮二者之间的比例没有特定的限制，本领域普通技术人员可根据检测限来调整二者之间的比例； 2).取5-10ml上清液(视上清液析出情况可适当调整取样量)置于比色管中，通入氮气，浓缩至没有溶剂即可； 3).给上述比色管中加入2-4mL pH＝7.0-8.0的缓冲液，再加入40-60μL胆碱酯酶+40-60μL显色剂二硫代-二硝基苯甲酸(DTNB)，优选分别加入50μL的上述酶和显色剂；同时做除不加样品外其它处理步骤均与检样组相同的对照组； 4).置于37℃恒温培养箱中，培养10-30分钟，优选培养30分钟； 5).从恒温培养箱中取出培养物，加入40-60μL碘化硫代乙酰胆碱(ATCI、底物)，优选加入50μL该底物； 6).振摇反应，然后移入酶标板或比色皿中，在420-430nm波长下，应用酶标仪或分光光度计测定吸光度，优选在425nm下检测； 7).由吸光度值的变化计算胆碱酯酶的抑制率
其中 对照组吸光度差为对照溶液反应3分钟吸光度的变化值； 样本吸光度差为样品溶液反应3分钟吸光度的变化值； 8)结果判定 结果以酶被抑制的程度(抑制率)表示。
当检测样品对酶的抑制率≥50％时，表示样品为阳性 在本发明的检测方法中，可使用的缓冲液为优选pH＝8.0的磷酸盐缓冲液。
在本发明的检测方法中，样品提取采用的丙酮优选为分析纯的。
在本发明的检测方法中，可采用本领域已知的常规仪器设备，例如，可选用如下仪器设备 移液枪，50μL-200μL；酶标仪(美国Thermo MK3)；打印机(Star HL-10)；10μL、100μL、250μL微量进样器；全温气候箱(MLR-350H)；生化培养箱(LRH-250-II微电脑控制广东省医疗器械厂)；空白酶标板；10mL比色管。
本发明的检测方法，优选地对如下农药的检测灵敏度相对较高Dichlorvos(敌敌畏)；Methamidophos(甲胺磷)；Monocrotophos(久效磷)；Methidathion(杀扑磷)。上述几种农药标准样品都购于美国ChemService公司。
在本发明的检测方法中，除非另有说明，所述酶都指胆碱酯酶。
从下表A可以看出，按照本发明的酶抑制率法特别适用于对于酶敏感的下述农药。经酶标仪测定，将得出的吸光度值带入公式计算出抑制率，从而确定本法的检出限。该方法对常用的农药敌敌畏、甲胺磷、久效磷、杀扑磷适用。
表A 农药限量的对比 本发明的方法快速方便、采用的仪器相对简单，它适用于现场的定性和半定量测定。经酶抑制率法检测出阳性后，可以通过标准仪器检验方法进一步检测，来鉴定残留农药品种及准确残留量。将这种样品初筛方法应用于原料奶的质量控制中，既减少了化验工作量，又对牛乳原料乳的安全控制具有重要的意义。本发明的酶抑制率法采用比色法进行农药残留速测，操作简单、快速、自动化程度高、灵敏度合适、成本低。
图1显示了按本发明的方法对10种不同浓度的敌敌畏培养后，测定的吸光度值(实施例1)，其中图中的1、2、3代表三个重复平行试验。
图2显示了按本发明的方法对10种不同浓度的甲胺磷培养后，测定的吸光度值(实施例2)，其中图中的1、2、3代表三个重复平行试验。
图3显示了按本发明的方法对10种不同浓度的久效磷培养后，测定的吸光度值(实施例3)，其中图中的1、2、3代表三个重复平行试验。
图4显示了按本发明的方法对10种不同浓度的杀扑磷培养后，测定的吸光度值(实施例4)，其中图中的1、2、3代表三个重复平行试验。
实施方式 实施例1 乳中敌敌畏农药残留的快速检测实验以及检测限验证 实验农药敌敌畏 小鼠经口LD5050～92mg/kg；大鼠经口50～110mg/kg。
实验采用10个浓度，三次重复试验结果(图1)。
将获得的不同浓度的抑制率在下述表1中列出，根据所得抑制率绘制图1。
实验步骤 1.取不同浓度农药的检验样品与丙酮适当比例混合振摇，静置10分钟，出现上清液即可。
2.取5ml上清液置于比色管中，通入氮气浓缩至没有溶剂即可。
3.上述比色管中加入2mL pH为8.0的磷酸缓冲液，再加入40μL胆碱酯酶以及40μL显色剂二硫代-二硝基苯甲酸(DTNB)；同时做除不加样品外其它处理步骤均与检样组相同的对照组。
4.置于37℃恒温培养箱中，培养10分钟。
5.从恒温培养箱中取出培养物，加入40μL碘化硫代乙酰胆碱(ATCI、底物)。
6.振摇反应后移入酶标板或比色皿中，应用酶标仪或分光光度计测定420nm处的吸光度值并依据下列公式计算各种不同浓度下农药的胆碱酯酶抑制率。
7.由吸光值的变化计算胆碱酯酶的抑制率
其中 对照组吸光度差为对照溶液反应3分钟吸光度的变化值； 样本吸光度差为样品溶液反应3分钟吸光度的变化值；表1 敌敌畏不同浓度的抑制率 从表1可以看出，酶对敌敌畏较为敏感，培养后抑制的程度大，吸光度明显降低。经计算可以看出，添加的10个浓度所计算出来的抑制率都大于98％。所以，敌敌畏在0.03ppm时就可以检测到，本方法适用于敌敌畏的快速检测。
实施例2 乳中甲胺磷农药残留的快速检测实验以及检测限验证 实验农药甲胺磷 甲胺磷急性毒性大鼠经口LD507.5mg/kg；大鼠吸入LC509mg/kg；大鼠经皮LD5050mg/kg。
甲胺磷设计10个浓度梯度，三次重复实验结果(图2)。
实验步骤 1.取不同浓度农药的检验样品与丙酮适当比例混合振摇，静置20分钟，出现上清液即可。
2.取7.5ml上清液置于比色管中，通入氮气，浓缩至没有溶剂即可。
3.上述比色管中加入3mL pH为7.0的磷酸缓冲液，再加入50μL胆碱酯酶以及50μL显色剂二硫代-二硝基苯甲酸(DTNB)；同时做除不加样品外其它处理步骤均与检样组相同的对照组。
4.置于37℃恒温培养箱中，培养20分钟。
5.从恒温培养箱中取出培养物，加入50μL碘化硫代乙酰胆碱(ATCI、底物)。
6.振摇反应后移入酶标板或比色皿中，应用酶标仪或分光光度计测定425nm处的吸光度值并依据下列公式计算各种不同浓度下农药的胆碱酯酶抑制率。
7.由吸光值的变化计算胆碱酯酶的抑制率
其中 对照组吸光度差为对照溶液反应3分钟吸光度的变化值； 样本吸光度差为样品溶液反应3分钟吸光度的变化值； 表2 甲胺磷不同浓度的抑制率 由表2可以看出，酶对甲胺磷较为敏感，培养后抑制的程度较大，吸光度降低较明显。经计算可以看出，添加的10个浓度所计算出来的抑制率从0.28ppm以后抑制率大于50％。所以，甲胺磷在半数致死量的范围内能被敏感的检测出来。 实施例3 乳中久效磷农药残留的快速检测实验以及检测限验证 实验农药久效磷 小鼠经口LD505mg/kg；大鼠经口LD5021mg/kg；兔经皮LD50149～709mg/kg 采用10个浓度，三次重复试验结果(图3)。
实验步骤 1.取不同浓度农药的检验样品与丙酮适当比例混合振摇，静置30分钟，出现上清液即可。
2.取10ml上清液置于比色管中，通入氮气，浓缩至没有溶剂即可。
3.上述比色管中加入4mL pH为7.5的磷酸缓冲液，再加入60μL胆碱酯酶以及60μL显色剂二硫代-二硝基苯甲酸(DTNB)；同时做除不加样品外其它处理步骤均与检样组相同的对照组。
4.置于37℃恒温培养箱中，培养30分钟。
5.从恒温培养箱中取出培养物，加入60μL碘化硫代乙酰胆碱(ATCI、底物)。
6.振摇反应后移入酶标板或比色皿中，应用酶标仪或分光光度计测定430nm处的吸光度值并依据下列公式计算各种不同浓度下农药的胆碱酯酶抑制率。
7.由吸光值的变化计算胆碱酯酶的抑制率
其中 对照组吸光度差为对照溶液反应3分钟吸光度的变化值； 样本吸光度差为样品溶液反应3分钟吸光度的变化值； 将获得的不同浓度的抑制率在下述表3中列出，根据所得抑制率绘制图3。表3 久效磷不同浓度的抑制率 由表3可以看出，酶对久效磷较为敏感，培养后抑制的程度较大，吸光度明显降低。经计算可以看出，添加的10个浓度所计算出来的抑制率在0.07ppm处抑制率大。所以，久效磷能够被敏感的检测出来，本发明的方法适于乳中久效磷的快速检测。 实施例4 乳中杀扑磷农药残留的快速检测实验以及检测限验证 实验农药杀扑磷 雄大鼠急性经口毒性LD50为26mg/kg，雌大鼠LD50为43.8mg/kg；对大鼠急性经皮毒性LD50为1546mg/kg，兔LD50为200mg/kg。
采用10个浓度，三次重复试验结果(图4)。
实验步骤 1.取不同浓度农药的检验样品与丙酮适当比例混合振摇，静置10-30分钟，出现上清液即可； 2.取10ml上清液置于比色管中，通入氮气，浓缩至没有溶剂即可； 3.上述比色管中加入4mL pH为7.2的磷酸缓冲液，再加入50μL胆碱酯酶以及50μL显色剂二硫代-二硝基苯甲酸(DTNB)；同时做除不加样品外其它处理步骤均与检样组相同的对照组； 4.置于37℃恒温培养箱中，培养30分钟； 5.从恒温培养箱中取出培养物，加入50μL碘化硫代乙酰胆碱(ATCI、底物)； 6.振摇反应后移入酶标板或比色皿中，应用酶标仪或分光光度计测定425nm处的吸光度值并依据下列公式计算各种不同浓度下农药的胆碱酯酶抑制率； 7.由吸光值的变化计算胆碱酯酶的抑制率
其中 对照组吸光度差为对照溶液反应3分钟吸光度的变化值； 样本吸光度差为样品溶液反应3分钟吸光度的变化值； 将获得的不同浓度的抑制率在下述表4中列出，根据所得抑制率绘制图4。
表4 杀扑磷不同浓度的抑制率 由表4可以看出，酶对杀扑磷极敏感，培养后抑制的程度极大，吸光度降低明显。经计算可以看出，添加的10个浓度所计算出来的抑制率都大于90％。所以，杀扑磷能够被敏感的检测出来。
总结 通过利用该方法对以上4种农药进行检验，得出该方法能够应用到牛奶常规农药残留的快速检测中，作为农药残留的初筛手段，在原料奶的质量控制中起到重要的作用，为食品安全严格把关提供一种快捷、有效的控制手段。
权利要求
1.一种乳中农药残留的快速检测方法，其特征在于，其包括如下步骤
1).取检验样品与丙酮混合，振摇，静置，出现上清液即可；
2).取5-10ml上清液置于比色管中，通入氮气，浓缩；
3).给上述比色管中加入2-4mL pH＝7.0-8.0的缓冲液，再加入40-60μL胆碱酯酶+40-60μL显色剂二硫代-二硝基苯甲酸(DTNB)；同时做除不加样品外其它处理步骤均与检样组相同的对照组；
4).将上述检样组和对照组置于37℃恒温培养箱中，培养；
5).从恒温培养箱中取出培养物，加入40-60μL的底物碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)；
6).将上述检样组和对照组振摇反应，然后移入酶标板或比色皿中，在420-430nm波长下，应用酶标仪或分光光度计测定吸光度；
7).由吸光度值的变化计算胆碱酯酶的抑制率
其中
对照组吸光度差为对照溶液反应3分钟吸光度的变化值；
样本吸光度差为样品溶液反应3分钟吸光度的变化值；
8)结果判定
结果以酶被抑制的程度(抑制率)表示，
当检测样品对酶的抑制率≥50％时，表示样品为阳性。
2.权利要求1的快速检测方法，其特征在于，其中所述缓冲液为磷酸缓冲液。
3.权利要求1的快速检测方法，其特征在于，其中步骤1)中静置时间为10-30分钟，恒温培养箱中的培养时间为10-30分钟。
4.权利要求2的快速检测方法，其特征在于，其中磷酸缓冲液的pH＝8.0。
5.上述任一项权利要求所述的检测方法，其特征在于，其中丙酮为分析纯的。
6.上述任一项权利要求所述的检测方法，其特征在于，其中步骤6)中的检测波长为425nm。
7.权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于，其中所述农药为敌敌畏、甲胺磷、久效磷、杀扑磷。
全文摘要
一种乳中农药的快速检测方法—酶抑制率法。本发明的酶抑制率法采用比色法进行农药残留速测，操作简单、快速、自动化程度高、灵敏度合适、成本低。本发明的方法尤其适于对原料奶中农药残留的快速测定。
文档编号G06F19/00GK101059423SQ200710085390
公开日2007年10月24日 申请日期2007年3月2日 优先权日2007年3月2日
发明者李翠枝, 王彦娟, 刘丽君 申请人:内蒙古伊利实业集团股份有限公司