专利名称：脂质体药物包封率测定方法
技术领域：
本发明涉及含药脂质体药物包封率的测定方法。
背景技术：
脂质体(Liposomes)是由磷脂与(或不与)附加剂为骨架膜材制成的具有双分子层结构的封闭囊状体。常见的磷脂分子结构中有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团，将适量的磷脂加至水或缓冲溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此相对缔和为双分子层，构成脂质体。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂、蛋黄磷脂等；合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。常用的附加剂为胆固醇。胆固醇也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制得稳定的脂质体，其作用是调节双分子层的流动性，减低脂质体膜的通透性。其他附加剂有十八胺、磷脂酸等，这两种附加剂能改变脂质体表面的电荷性质，从而改变脂质体的包封率、体内外其他参数。
脂质体可分为三类小单室(层)脂质体，粒径为20-50nm，经超声波处理的脂质体，绝大部分为小单室脂质体；多室(层)脂质体，粒径约为400-3500nm，显微镜下可观察到尤如洋葱断面或人手指纹的多层结构；大单室脂质体，粒径约为200-1000nm，用乙醚注入法制备的脂质体多为这一类。
脂质体的制法有多种，根据药物的性质或需要进行选择。(1)薄膜分散法这是一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声处理后得到小单室脂质体。此法优点是操作简便，脂质体结构典型，但包封率较低。(2)注入法有乙醚注入法和乙醇注入法等。“乙醚注入法”是将磷脂等膜材料溶于乙醚中，在搅拌下慢慢滴于55-65℃含药或不含药的水性介质中，蒸去乙醚，继续搅拌1-2h，即可形成脂质体。(3)逆相蒸发法系将磷脂等脂溶性成分溶于有机溶剂，如氯仿中，再按一定比例与含药的缓冲液混合、乳化，然后减压蒸去有机溶剂即可形成脂质体。该法适合于水溶性药物、大分子活性物质，如胰岛素等的脂质体制备，可提高包封率。(4)冷冻干燥法适于在水中不稳定药物脂质体的制备。(5)熔融法采用此法制备的多相脂质体，其物理稳定性好，可加热灭菌。
在制备含药脂质体时，根据药物装载的机理不同，可分为“主动载药”与“被动载药”两大类。所谓“主动载药”，即通过内外水相的不同离子或化合物梯度进行载药，主要有K+-Na+梯度和H+梯度(即pH梯度)等。传统上，人们采用最多的方法是“被动载药”法。所谓“被动载药”，即首先将药物溶于水相或有机相(脂溶性药物)中，然后按所选择的脂质体制备方法制备含药脂质体，其共同特点是在装载过程中脂质体的内外水相或双分子层膜上的药物浓度基本一致，决定其包封率的因素为药物与磷脂膜的作用力、膜材的组成、脂质体的内水相体积、脂质体数目及药脂比(药物与磷脂膜材比)等。对于脂溶性的、与磷脂膜亲和力高的药物，“被动载药”法较为适用。而对于两亲性药物，其油水分配系数受介质的pH值和离子强度的影响较大，包封条件的较小变化，就有可能使包封率有较大的变化。
评价脂质体质量的指标有粒径、粒径分布和包封率等。其中脂质体的包封率(即，包入脂质体内的药物量与投料量的重量百分比)是衡量脂质体内在质量的一个重要指标。然而，目前常用的包封率测定方法往往存在较大的问题。如方法的准确性、重复性差，不同测定方法的测定结果更是难以一致，同一脂质体样品采用不同的方法测定往往得到不同的结果。总的来说，脂质体的包封率测定方法分为平衡法与非平衡法，前者测得的数据较可靠，后者测得的数据经常会由于测定过程中包封药物的泄漏而降低，但是，如果药物在脂质体中滞留性较好，不会因为外水相药物浓度降低而泄漏，平衡法与非平衡法测得的结果会比较一致。Teshima等人的研究也证明了这一点(Teshima M，Kawahami S，Nishida K，et al.Prednisone retention in integrated liposomes by chemical approachand pharmaceutical approach[J].J Control Release，2004，97(2)211-218.)，他们用超滤法、凝胶层析法测定泼尼松龙脂质体的包封率，前法的测定结果在90％以上，而后法的测定结果均小于4.5％，通过将泼尼松龙制备成棕榈酸酯后再做成脂质体，用上述两种方法进行包封率测定，结果都在85％以上。平衡法包括超速离心法、超(高)速离心与离心超滤法联用，这两种方法需要昂贵的离心机或超滤管，同时耗时长，因此成本(包括时间成本)很高，更重要地，这两种方法并不能对脂质体与外水相进行准确地分离，前者分离出来的外水相很可能有小单室脂质体存在，导致测得的外水相浓度偏高，这将影响了测定结果的准确性。
熊非等人报道了用反透析法测定灯盏花素脂质体的包封率(熊非，朱家壁，王维，等.灯盏花素纳米脂质体包封率测定方法研究[J].药学学报，2004，39(9)755-757.)，该法因为只向脂质体混悬液体系加入相对体系本身体积很少的透析液，测定过程中对体系的稀释作用可以忽略，所以这种方法可以看作是一种近似平衡法。因此可以用于测定稀释后药物容易泄漏的脂质体的包封率。他们按下式计算脂质体的包封率，EE=Ctotal×V0-Cfree×V1Ctotal×V0×100%---(1)]]>式(1)中EE为包封率，Ctotal为待测脂质体中药物的总浓度，Cfree为外水相中药物的浓度，V0为待测脂质体样品的取样体积，V1为V0与反透析液体积之和。因为反透析液体积很小，所以V1与V0很接近。不难看出，这个公式中Cfree×V1表示游离药物的总量，作者用V1表示外水相总体积，显然是不妥的，因为脂质体混悬液体系中脂质体本身也要占一定的体积，除非脂质体的体积在整个体系中小到可以忽略不计。因此要测得准确的包封率，必须准确测定外水相体积，一种常规方法是用超(高)速离心将脂质体沉积，与外水相实现分离，然后称定重量。但是此法对仪器要求高，耗时长，而且结果误差大的缺点已在上面提到。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种能准确测定含药脂质体包封率的方法。该测定方法设计了一种全新的测定外水相体积的方法，进而能准确测定含药脂质体包封率。
为了解决上述技术问题，本发明的技术构思是利用一种水溶性的物质，这种物质与脂质双分子层不发生相互作用，在反透析测脂质体包封率的过程中，将一定量的该物质加到脂质体混悬液中，达到透析平衡后通过测定透析袋中该物质的浓度即可求得外水相的体积，将外水相体积替代公式(1)中的V1即可求得准确的脂质体包封率。
相似地，本发明还将这种辅助物质定外水相体积的方法与离心超滤法结合测定脂质体的包封率，即，在离心超滤之前将一定量的该水溶性的物质加入到待测样品中，超滤得到适量滤出液后分别测定其中药物与该水溶性的物质的浓度即可计算出游离药物总量，进而求得包封率。
本发明人制备了一种易被离心沉淀的空白脂质体，将一定体积的5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)溶液加到上述脂质体混悬液中，混匀后用透析法求得外水相的5-Fu浓度，接着用离心沉淀法测得脂质体的外水相的体积，根据外水相体积与5-Fu浓度求得外水相中5-Fu的总量，此值除以加入的5-Fu总量即可求得脂质体混悬液中5-Fu的回收率，三次测定的结果分别为94.8％、93.2％、95.2％，回收率及其精密度结果良好，证明了5-Fu可用以准确测定脂质体混悬液的外水相体积。
利用相同的方法测定酚红在空白脂质体混悬液中回收率，三次测定结果分别为95.5％、96.1％、96.6％，回收率及其精密度结果良好，由此证明了酚红也可以准确测定脂质体混悬液的外水相体积。
由此，本发明人发现上述水溶性物质满足与脂质双分子层不发生相互作用的条件，进而提出如下测定含药脂质体包封率的方法。
本发明提出的具体技术解决方案之一一种脂质体包封率测定方法，取待测脂质体混悬液样品ms，将体积为V5-Fu浓度为C5-Fu的与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质的溶液加入到脂质体混悬液中，混合均匀；将装有水合介质的透析袋投入其中，达到透析平衡后，测定透析液中药物的浓度为CAE、该水溶性物质的浓度为CFE，测定脂质体混悬液中药物的含量为CT，按下式计算脂质体的药物包封率EE。
EE=(1-C5-Fu×V5-FuCAECFE·mS·CT)×100%]]>作为技术解决方案之一的优选方案，上述与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质最好为5-氟尿嘧啶或酚红。
本发明提出的具体技术解决方案之二一种脂质体包封率测定方法，取待测脂质体混悬液样品WS，将体积为V5-Fu浓度为C5-Fu的与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质的溶液加入到脂质体混悬液中，混合均匀，离心，分层后取清液置于超滤单元中进行离心超滤，得到滤出液，测定滤出液中药物的浓度为CAF、该水溶性物质的浓度为CFF，测定脂质体混悬液中药物含量为CT，按下式计算脂质体的药物包封率EE。
EE=(1-C5-Fu×V5-FuCAFCFF·WS·CT)×100%]]>作为技术解决方案之二的优选方案，上述与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质最好为5-氟尿嘧啶或酚红。
相对于现有技术，本发明以与脂质双分子层不发生相互作的水溶性物质测定外水相体积的反透析法与离心-超滤法是两种在近似平衡条件下测定脂质体包封率的方法，因此具备平衡测定法的所有优点，同时本发明的两种方法精密度高，准确性好，耗时短，实验成本低。
相对于现有技术，本发明提出的离心-超滤法需要的样品量很小，同一次实验可以方便的进行多份样品的测定，是测定脂质体的包封率的理想方法，集中小耗样量、准确、高效、大样品吞吐量等优点。
相对于现有技术，本发明的两种测定方法(包括其他的平衡法)对于探明脂质体与被包封药物的相互作用很有价值，对于一份脂质体混悬液，只要测定稀释适当倍数前后药物包封率的变化即可了解药物在脂质双分子层中的滞留特性，如果稀释后药物包封率未下降或下降不明显，就说明药物在脂质双分子层中滞留好，如果稀释后药物包封率明显下降，就说明药物在脂质双分子层滞留不好。
图1是不同时间透析袋中全缘千里光碱的浓度变化示意图。
图2是不同时间透析袋中5-Fu的浓度变化示意图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1(以辅助物质测定外水相体积的反透析法测定全缘千里光碱脂质体的包封率)。
1.1全缘千里光碱脂质体样品的制备采用干膜分散法制备全缘千里光碱(A碱)脂质体。取A碱原料药0.2g，注射级大豆磷脂2g，胆固醇0.5g，维生素E 0.1g置于500ml茄形瓶中，加入氯仿50ml使溶解，60℃，50r/min旋转减压蒸去氯仿使形成脂质干膜，室温真空干燥12h以除去残余氯仿，用50ml CBS 4.0水化干膜，充氮气后摇床振摇使瓶壁上的膜溶散，再在4℃冰箱静置12h，最后用高剪切分散仪分散使整个体系均匀，即得脂质体成品，充氮气后冷藏备用。
1.2外水相及脂质体中A碱浓度的测定方法采用HPLC法测定外水相及脂质体中A碱的浓度，测定脂质体样品时用适量10％曲拉通X-100乙醇溶液破坏脂质体。
1.3外水相中5-Fu的浓度测定方法采用HPLC法测定外水相中5-Fu的浓度。
1.4反透析平衡时间的考察取10ml脂质体混悬液置于烧杯中，加入1.626mg/ml 5-FU溶液0.2ml，混合均匀，同时透析袋中装入0.5ml CBS 4.0水化液，将透析袋放入脂质体混悬液中，磁力搅拌下进行透析，间隔一定的时间吸取袋内透析液25μl，稀释适当倍数后分别进样20μl在不同条件下HPLC测定其中A碱与5-Fu的浓度。将透析袋中不同时间的两种药物的浓度对时间作图，如图1、2所示。由图中可以看出A碱在4h内基本达到透析平衡，5-FU在2h内达到透析平衡，为确保两药物都充分达到透析平衡，故反透析平衡时间确定为6h。
1.5反透析回收率的考察取不同量的四份A碱原料药，分别以CBS 4.0配制0.8、2、3、4mg/ml的溶液，各取10ml置于烧杯中，依次向不同浓度的A碱溶液中加入1.626mg/ml的5-Fu溶液500、300、400、500μl，混合均匀后每份溶液分别取25μl的试样两份，分别用于测定透析前溶液中A碱浓度与5-Fu的浓度，随后将装有400μlCBS 4.0水化液的透析袋放入不同的混合溶液中(除第一份混合液中的透析袋装有500μl水化液)进行反向透析，6h后透析结束，从各个透析袋中分别取25μl的试样两份，分别用于测定透析袋中A碱与5-Fu的浓度，所有样品的浓度测定按2.2、2.3中的条件进行。透析回收率的计算公式如下RA=CA1(V0′+Vd)CA0V0′---(2)]]>RF=CF1(V0′+Vd)CF0V0′---(3)]]>V0′＝V0+VF-VS1(4)式(2)、(3)、(4)中RA、RF分别为A碱与5-Fu的回收率，CA0、CF0分别为透析前混合溶液中A碱与5-Fu的浓度，CA1、CF1分别为透析结束时透析袋中A碱与5-Fu的浓度，V0为不同浓度A碱溶液的取量，VF为5-Fu溶液的取量，VS1为用于测定透析前混合液中两药物浓度的两份样品的总体积，V0′为透析前两药物混合溶液的总体积。样品溶液浓度测定结果及回收率计算结果见表1、2，由表中可以看出，反透析过程中A碱与辅助物质5-Fu的回收率都良好，而且重复性很好，说明反透析法可以准确、精密地测定外水相中药物浓度。
表1反透析中全缘千里光碱的回收率
注*CINT全缘千里光碱的标示浓度。
表2反透析中5-Fu的回收率
注*V5-Fu为加全混合溶液中的5-Fu溶液(1.626mg/ml)的体积。
1.6反透析液中是否含有脂质体的检查采用显微镜观察法与A450浊度检查法检查透析液中是否有脂质体的存在。
1.6.1显微镜观察法取反透析液制备多个标本，在显微镜下(在10×40、10×100两个放大倍数下)进行观察，每个标本都观察10个以上的视野，均未发现脂质体的存在。
1.6.2 A450浊度检查法取3ml CBS 4.0水化液置于透析袋内，袋外为A碱脂质体混悬液样品10ml，透析6h后，取袋内液在450nm测浊度，与蒸馏水一致。说明透析液中无脂质体存在。
1.7改进的反透析法测定脂质体包封率将待测脂质体混悬液摇匀，显微镜下观察脂质体混悬液中是否有药物结晶，如果有药物结晶，则放弃本法；如果没有药物结晶，开始测定。取待测脂质体混悬液样品ms(g)，精密称定，置于烧杯中，加入1.626mg/ml 5-Fu溶液200μl，混合均匀后将装有20μl水合介质的透析袋投入，进行透析，6h后取出透析袋，从袋中取出25μl的试样两份，分别稀释适当倍数后用于测定透析液中A碱的浓度(CAE)与5-Fu的浓度(CFE)。同时，测定脂质体混悬液中A碱含量CT(mg/g混悬液)。按下式计算脂质体的药物包封率(EE)。
EE=(1-1.626×0.2CAECFE·mS·CT)×100%---(5)]]>表3脂质体样品包封率测定结果
对1.1制备的脂质体样品进行包封率测定，平行3份，结果见表3，由表中可以看出样品测定的重复性较好。该样品用离心-超滤法测定，测定两次，结果分别为39.23％、35.61％，两种方法的测定结果基本一致。
对另一份pH梯度载药的脂质体样品的测定结果见表4，该脂质体pH梯度载药前的包封率测定值见同表。
表4脂质体样品包封率测定结果
实施例2(以辅助物质测定外水相体积的离心超滤法测定脂质体的包封率)2.1超滤对游离药物溶液浓度的影响取三个不同浓度(分别为1.22、0.50、0.10mg/ml)的A碱水溶液各三份，每份200μL，进行超滤(超滤单元采用Microcon YM 100K，Millipore)，以HPLC分别测定滤出液与超滤前溶液中A碱对应的峰面积。结果见表5，可以看出，超滤膜对药物有少量吸附，当药物浓度足够大时，可以认为超滤对药物溶液浓度无影响。
表5超滤对游离全缘千里光碱浓度的影响
取三个不同浓度(分别为0.01626、0.008130、0.003252mg/ml)的5-Fu水溶液各三份，每份200μL，进行超滤(超滤单元采用Microcon YM100K，Millipore)，以HPLC分别测定滤出液与超滤前溶液中5-Fu对应的峰面积。结果见表6，可以看出，超滤膜对药物有少量吸附，当药物浓度足够大时，可以认为超滤对药物溶液浓度无影响。
表6超滤对游离5-Fu浓度的影响
2.2改进的离心-超滤法测定脂质体包封率取待测脂质体样品，确认样品中无药物结晶存在后开始测定，否则，放弃本法。取待测样品约1g，精密称定重量(WS)，置于1.5ml ependoff管，加入1.626mg/ml的5-Fu溶液20μl，混匀，5000r/min，4℃下离心。当样品有一定分层后，取适量清液置于超滤单元(Microcon YM 100K，Millipore)中进行离心超滤，得到适量滤出液后停止离心，从滤出液中取出25μl的试样两份，分别稀释适当倍数后用于测定滤出液中A碱的浓度(CAF)与5-Fu的浓度(CFF)，同时，测定脂质体混悬液中A碱含量GT(mg/g混悬液)。按下式计算脂质体的药物包封率(EE)。
EE=(1-1.626×0.02CAFCFF·WS·CT)×100%---(3)]]>表7脂质体样品包封率测定结果
应用本法对一份A碱脂质体样品进行包封率测定，平行4份，结果见表7，由表中可以看出样品测定的重复性较好(RSD＝1.8％)。
经显微镜观察法与A450浊度法检查，结果表明超滤滤出液中无脂质体存在。
实施例3(以辅助物质测定外水相体积的反透析法测定全缘千里光碱脂质体的包封率)。
试验步骤和试验条件同实施例1，用酚红替换5-Fu，试验结果和实施例1相同。
实施例4(以辅助物质测定外水相体积的离心超滤法测定脂质体的包封率)试验步骤和试验条件同实施例2，用酚红替换5-Fu，试验结果和实施例2相同。
权利要求
1.一种脂质体药物包封率测定方法，其特征在于，取待测脂质体混悬液样品ms，将体积为V5-Fu浓度为C5-Fu的与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质的溶液加入到脂质体混悬液中，混合均匀；将装有水合介质的透析袋投入其中，达到透析平衡后，测定透析液中药物的浓度为CAE、该水溶性物质的浓度为CFE，测定脂质体混悬液中药物的含量为CT，按下式计算脂质体的药物包封率EE。EE=(1-C5-Fu×V5-FuCAECFE·msCT)×100%]]>
2.如权利要求1所述的脂质体药物包封率测定方法，其特征在于，所述与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质为5-氟尿嘧啶。
3.如权利要求1所述的脂质体药物包封率测定方法，其特征在于，所述与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质为酚红。
4.一种脂质体药物包封率测定方法，其特征在于，取待测脂质体混悬液样品WS，将体积为V5-Fu浓度为C5-Fu的与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质的溶液加入到脂质体混悬液中，混合均匀，离心，分层后取清液置于超滤单元中进行离心超滤，得到滤出液，测定滤出液中药物的浓度为CAF、该水溶性物质的浓度为CFF，测定脂质体混悬液中药物含量为CT，按下式计算脂质体的药物包封率EE。EE=(1-C5-Fu×V5-FuCAFCFF·WS·CT)×100%]]>
5.如权利要求4所述的脂质体药物包封率测定方法，其特征在于，所述与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质为5-氟尿嘧啶。
6.如权利要求4所述的脂质体药物包封率测定方法，其特征在于，所述与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质为酚红。
全文摘要
本发明公开了一种含药脂质体药物包封率的测定方法。本发明以与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质加到脂质体混悬液中，达到透析平衡后通过测定透析袋中该水溶性物质的浓度即可求得外水相的体积，进而测定脂质体包封率；本发明还在离心超滤之前将一定量的与脂质双分子层不发生相互作用的水溶性物质加入到待测样品中，超滤得到适量滤出液后分别测定其中药物与该水溶性物质的浓度即可计算出游离药物总量，进而求得包封率。本发明具备平衡测定法的所有优点，精密度高，准确性好，耗时短，实验成本低。
文档编号G06F19/00GK101017164SQ20061002924
公开日2007年8月15日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者郑杭生, 徐莲英, 陈建明 申请人:上海中医药大学