基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条及其应用
【专利摘要】基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条及其应用，属于免疫分析技术领域。在PVC底板上依次设置样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；当基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属时，所述金标抗体为抗体2H8的胶体金溶液；当基于单克隆抗体的检测食品中单增李斯特菌时，金标抗体为抗体A号的胶体金溶液。本发明开发了基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条。适用于食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的高特异性、高准确性、较高灵敏度、简便快速分析。
【专利说明】
基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单増李斯特菌的胶体金试纸条及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条及其应用，属于免疫分析技术领域。
【背景技术】
[0002]单增李斯特菌是一种兼性厌氧性革兰氏阳性细菌，属于李斯特菌属。它主要以食物为传染媒介，是全球范围内的最致命的食源性致病菌之一。李斯特菌在环境中分布广泛，肉类、蛋类、禽类、乳制品、蔬菜等均已被证实是李斯特菌的感染源。感染李斯特菌后会引起肌肉疼痛、恶心、腹泻等症状，严重的可引起血液和脑组织感染，而且由于该菌在4 °C冷藏温度下仍可生长繁殖，被污染的冷藏食品对人类健康具有很大威胁。因此很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。
[0003]李斯特菌属共分为10个种，包括单增李斯特菌(L.monocytogenes)、绵羊李斯特菌(L.1vanovii)、英诺克李斯特菌(L.1nnocua)、威尔李斯特菌(L.welshimeri)等。其中的单增李斯特种又分为13种亚型，种类较为繁多，而单增李斯特菌是引起人类致病的主要原因。然而，作为食品卫生学的指标，李斯特菌常常被要求专门进行检测。因此，检测食品中的李斯特菌和单增李斯特菌均具有十分重要的意义。目前检测李斯特菌属和单增李斯特菌主要有平板培养法、聚合酶链式反应法(PCR)和酶联免疫方法(ELISA)。
[0004]胶体金试纸条作为检测微生物的常用方法具有简便、快速、较灵敏、特异性好、不需要大型仪器、易于推广的特点。然而ELISA配对抗体并不一定可以建立胶体金试纸条，这是由于胶体金试纸条反应时间很短(lOmin)，对抗体亲和力等的要求更高。目前已有李斯特菌和单增李斯特菌胶体金试纸方法的研究，但面临的问题主要是所采用的单克隆抗体或多克隆抗体以及建立的检测方法的交叉反应难以达到要求，即对李斯特菌属内不同种的细菌或单增李斯特菌种内不同的血清型均可识别，同时对其它杂菌不存在交叉反应，这对于实际应用于样品检测十分重要。而且，如何实现对李斯特菌属和单增李斯特菌的准确性、特异性检测是目前胶体金试纸条方法仍需要解决的问题。
[0005]本发明采用可组合配对的2株李斯特菌属特异性单克隆抗体及I株单增李斯特菌特异性抗体，成功建立起李斯特菌属特异性及单增李斯特菌特异性的胶体金试纸条方法，为食品中李斯特菌属及单增李斯特菌的监测与控制提供了切实有效的快速分析手段。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服上述不足之处，建立一种具有高特异性、高准确性、较高灵敏度、操作简便的胶体金试纸条方法用于食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的快速检测。
[0007]本发明的技术方案:
1、开发李斯特菌属特异性的胶体金试纸条:基于李斯特菌属特异性的配对单克隆抗体2G7(捡测抗体)和2H8(金标抗体)，该配对抗体特异性识别李斯特菌属菌体表面的P60蛋白，因而具有均一性、特异性检测李斯特菌属的可能。经测试表明通过该配对抗体建立的胶体金试纸条成功检测了 12株李斯特菌，阳性率100%，同时与其它测试菌无交叉反应。
[0008]2、开发单增李斯特菌特异性的胶体金试纸条:首先，建立了可特异性检测单增李斯特菌的配对抗体。实验测试表明，单增李斯特菌特异性的单克隆抗体A号(金标抗体)可与李斯特菌属特异性的单克隆抗体2G7(捡测抗体)形成配对检测单增李斯特菌表面的P60蛋白，并在ELISA体系中特异性检测单增李斯特菌的培养上清。
[0009]在此基础上，基于李斯特菌属特异性的单克隆抗体2G7(检测抗体)和单增李斯特菌特异性的单克隆抗体A号(金标抗体)开发了胶体金试纸条。经测试表明该胶体金试纸条成功检测了 8株单增李斯特菌的培养上清，同时与4株李斯特菌及其它测试菌无交叉反应。
[0010]具体机理是金标抗体A号识别P60蛋白上单增李斯特菌特异性的多肽，可特异性与单增李斯特菌分泌在上清中的P60蛋白结合，并被检测线上可特异识别李斯特菌属P60蛋白的抗体2G7捕获。
[0011]基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条，包括吸水垫、硝酸纤维素膜、质控线、检测线、样品垫和PVC底板，另配有金标抗体；
在PVC底板上依次设置样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;硝酸纤维素膜直接设置于PVC底板上;样品垫一端搭接于硝酸纤维素膜上，另一端直接设置于PVC底板上;吸水垫一端设置于PVC底板上，另一端搭接于硝酸纤维素膜上；
所述硝酸纤维素膜上依次设有质控线和检测线;所述质控线上包被羊抗鼠IgG 二抗，检测线上包被检测抗体2G7 ；
当基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属时，所述金标抗体为抗体2H8的胶体金溶液;当基于单克隆抗体的检测食品中单增李斯特菌时，金标抗体为抗体A号的胶体金溶液。
[0012]所述基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条的制备方法，步骤为:
(I)金标抗体的制备:
a、胶体金溶液的合成:采用柠檬酸还原法合成30nm的金纳米粒子，在洗净的烧瓶中加入300mL质量浓度0.01%的氯金酸溶液，在磁力搅拌下加热至完全沸腾，向溶液中快速加入4.8mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，将溶液煮沸1min直至颜色变为透亮的酒红色，将烧瓶置于室温冷却，并在4°C保藏；
b、金标抗体的偶联:分别采用抗体2H8或抗体A号标记胶体金颗粒，具体过程为:用0.1M碳酸钾溶液将ImL步骤a制备的胶体金溶液pH调至7.5;加入单克隆抗体2H8或抗体A号1yg并在室温下反应2h;随后，加入50yL质量体积比为10%的牛血清白蛋白BSA的超纯水溶液，室温下继续反应2 h;4°C、6000g、20min条件下离心胶体金溶液，去除未偶联的BSA和单克隆抗体；用含有质量浓度为0.1%的NaN3、0.2% Tween,0.2%蔗糖的0.0lM的1mM磷酸盐缓冲液重悬金标抗体，4°C保藏，即得抗体2H8胶体金溶液或抗体A号胶体金溶液；
(Π)胶体金试纸条的制备:将硝酸纤维素膜固定于PVC底板上，将吸水垫粘附在硝酸纤维素膜与PVC底板靠近质控线的一端，将样品垫粘附在硝酸纤维素膜与PVC底板的靠近检测线的另一端;将检测抗体2G7稀释到lmg/mL，用喷膜机喷至检测线处;将0.5 mg/mL的羊抗鼠IgG二抗喷至质控线处，37 °C烘干2h，即制得基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条。
[0013]所述基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条的应用，当金标抗体为抗体2H8时，用于特异性检测食品中李斯特菌属；当金标抗体为抗体A号时，用于特异性检测食品中单增李斯特菌。
[0014]所述李斯特菌属包括4种李斯特菌和8种单增李斯特菌。
[0015]所述8种单增李斯特菌为:ATCC19111(l/2a)、ATCC 19115 (4b)、ATCC 19118(4e)、CMCC 54002(l/2c)、CMCC 54003^CMCC 54004^CMCC 54007和冻牛肉分离株；
所述4种李斯特菌为:ATCC 19119(Listeria ivanovii )、ATCC 33090(Listeriainnocua, 6a)、ATCC 35897(Listeria welshimeri, 6b)和ATCC 25400(Listeria grayi)。
[0016]样品稀释:P60蛋白均用1mMPBS稀释到250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、lng/mL并用空白PBS做对照。采用李斯特菌属试纸条检测时，将培养的李斯特菌菌液用1mM PBS稀释到17 CFU/mL、5 X 106CFU/mL、106CFU/mL、5 X 15CFU/mL、105CFU/mL、5 X 14 CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL并用空白 PBS做对照。采用单增李斯特菌试纸条检测时，将单增李斯特菌培养上清用1mM PBS梯度稀释3倍、9倍、27倍并用未稀释的空白培养液做对照。
[0017]所述基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条的应用，具体步骤为:
取7yL金标抗体与47yL重悬液，即含质量浓度为0.2% Tween、0.2%蔗糖的0.0lM的10mM磷酸盐缓冲液，150yL待测样品在微孔板中反应5min，随后将胶体金试纸条插入微孔板中，在层析作用下，与金标抗体结合的目标物，即李斯特菌属或单增李斯特菌P60蛋白，从样品垫与检测线上捕获抗体，与质控线上的羊抗鼠IgG 二抗反应，从而在质控线和检测线上出现红色；1min后通过肉眼对结果进行判读，质控线和检测线同时出现红色即为阳性，检测线不显色而质控线出现红色即为阴性。
[0018]本发明方法的检测分析原理是:李斯特菌属胶体金试纸条分别采用李斯特菌属特异性配对单克隆抗体2G7和2H8作为检测线上的捕获抗体及金标检测抗体，以羊抗鼠IgG 二抗作为质控线上的包被抗体。金标抗体识别李斯特菌表面的P60蛋白，先与样品中的李斯特菌反应，在层析作用下到检测线被识别李斯特菌表面的P60蛋白另一位点的抗体2G7所捕获，其余抗体被质控线上的羊抗鼠IgG二抗捕获，因而在检测线和质控线出现金纳米粒子的红色，被肉眼判读为阳性，检测线颜色深浅与样品中李斯特菌含量呈正比。由于筛选的配对单克隆抗体均一性识别李斯特菌属内细菌，因此检测具有李斯特菌属特异性。同时由于其它菌不表达P60蛋白而不会在检测线显色，仅在质控线出现红色。
[0019]单增李斯特菌胶体金试纸条分别采用配对的李斯特菌属单克隆抗体2G7和单增李斯特菌特异性A号作为检测线上的捕获抗体及金标抗体，以羊抗鼠IgG 二抗作为质控线上的包被抗体。金标抗体A号可特异性识别单增李斯特菌分泌到上清的P60蛋白，并在层析作用下到检测线被识别李斯特菌属P60蛋白的抗体2G7所捕获，其余抗体被质控线上的羊抗鼠IgG二抗捕获，因而在测试线和质控线出现金纳米粒子的红色，被肉眼判读为阳性，检测线颜色深浅与样品中单增李斯特菌含量呈正比。由于该配对抗体中金标抗体A号可特异性、均一性识别单增李斯特菌分泌的P60蛋白，因此检测具有单增李斯特菌特异性，而不与其它李斯特菌产生交叉反应。同时由于其它菌不表达P60蛋白而不会在检测线显色，仅在质控线出现红色。
[0020]本发明的有益效果:本发明开发了基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的胶体金试纸条。基于李斯特菌属特异性配对单克隆抗体2G7和2H8作为检测线上的捕获抗体及金标检测抗体，可均一性识别李斯特菌属菌体表面的P60蛋白，测试表明成功检测了 12株测试的李斯特菌，阳性率100%，同时与其它测试菌无交叉反应。适用于食品中李斯特菌属的高特异性、高准确性、较高灵敏度、简便快速分析。
[0021]还开发了基于单克隆抗体的检测食品中单增李斯特菌特异性的胶体金试纸条。首先，建立了可特异性检测单增李斯特菌的配对抗体。实验测试表明，基于李斯特菌属特异性的单克隆抗体2G7(检测线抗体)和单增李斯特菌特异性的单克隆抗体A号(金标抗体)，建立的胶体金试纸条成功检测了测试的8株单增李斯特菌，同时与4株李斯特菌及其它测试菌无交叉反应。适用于食品中单增李斯特菌的高特异性、高准确性、较高灵敏度、简便快速分析。
[0022]生物材料样品保藏:
单克隆细胞株2G7，保藏编号CGMCC N0.10875;单克隆细胞株2H8，保藏编号CGMCC N0.10876，公开于申请号201610039900.6中；
抗体A号，保藏编号:CGMCC N0.9301，公开于申请号201410260781.8中。
【附图说明】
[0023]图1-1李斯特菌属胶体金试纸条示意图。
[0024]图1-2单增李斯特菌胶体金试纸条示意图。
[0025]1、吸水垫;2、硝酸纤维素膜;3、质控线;4、检测线;5、样品垫;7、PVC底板;6、金标抗体。
[0026]图2-1李斯特菌属胶体金试纸条检测P60蛋白灵敏度示意图。
[0027]图2-2单增李斯特菌胶体金试纸条检测P60蛋白灵敏度示意图。
[0028]图3李斯特菌属胶体金试纸条检测12种李斯特菌(菌液)结果示意图。
[0029]图4-1单增李斯特菌胶体金试纸条检测8种单增李斯特菌(培养上清)结果示意图。
[0030]图4-2单增李斯特菌胶体金试纸条检测4种李斯特菌(培养上清)结果示意图。
[0031 ]图5-1李斯特菌属胶体金试纸条交叉反应示意图。
[0032]图5-2单增李斯特菌胶体金试纸条交叉反应示意图。
【具体实施方式】
[0033]实施例1胶体金试纸条
基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条，包括吸水垫1、硝酸纤维素膜2、质控线3、检测线4、样品垫5、PVC底板7，另配有金标抗体6;
在PVC底板7上依次设置样品垫5、硝酸纤维素膜2和吸水垫I;硝酸纤维素膜2直接设置于PVC底板7上;样品垫5—端搭接于硝酸纤维素膜2上，另一端直接设置于PVC底板7上;吸水垫I 一端设置于PVC底板7上，另一端搭接于硝酸纤维素膜2上；
所述硝酸纤维素膜2上依次设有质控线3和检测线4;所述质控线3上包被羊抗鼠IgG 二抗，检测线4上包被抗体2G7 ；
当基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属时，所述金标抗体6为抗体2H8的胶体金溶液;当基于单克隆抗体的检测食品中单增李斯特菌时，金标抗体6为抗体A号的胶体金溶液。
[0034]实施例2
所述基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条的制备方法，步骤为:
(1)金标抗体6的制备:
a、胶体金溶液的合成:采用柠檬酸还原法合成30nm的金纳米粒子，在洗净的烧瓶中加入300mL质量浓度0.01%的氯金酸溶液，在磁力搅拌下加热至完全沸腾，向溶液中快速加入4.8mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，将溶液煮沸1min直至颜色变为透亮的酒红色，将烧瓶置于室温冷却，并在4°C保藏；
b、金标抗体的偶联:分别采用抗体2H8或抗体A号标记胶体金颗粒，具体过程为:用0.1M碳酸钾溶液将ImL步骤a制备的胶体金溶液pH调至7.5;加入单克隆抗体2H8或抗体A号1yg并在室温下反应2h;随后，加入50yL质量体积比为10%的牛血清白蛋白BSA的超纯水溶液，室温下继续反应2 h;4°C、6000g、20min条件下离心胶体金溶液，去除未偶联的BSA和单克隆抗体；用含有质量浓度为0.1%的NaN3、0.2% Tween,0.2%蔗糖的0.0lM的1mM磷酸盐缓冲液重悬金标抗体，4°C保藏，即得抗体2H8胶体金溶液或抗体A号胶体金溶液；
(2)胶体金试纸条的制备:将硝酸纤维素膜2固定于PVC底板7上，将吸水垫I粘附在硝酸纤维素膜2与PVC底板7靠近质控线3的一端，将样品垫5粘附在硝酸纤维素膜2与PVC底板7的靠近检测线4的另一端;将检测抗体2G7稀释到lmg/mL，用喷膜机喷至检测线4处;将0.5 mg/mL的羊抗鼠IgG二抗喷至质控线3处，37°C烘干2h，即制得基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条。
[0035]当金标抗体为抗体2H8时，能够用于特异性检测食品中李斯特菌属；当金标抗体为抗体A号时，能够用于特异性检测食品中单增李斯特菌。
[0036]实施例3湿法检测P60蛋白
样品稀释:P60蛋白均用1mM PBS稀释到250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、Ing/mL并用空白PBS做对照。分别采用李斯特菌属胶体金试纸条及单增李斯特菌胶体金试纸条检测。取7yL金标抗体与47yL重悬液，即含质量浓度为0.2%Tween、0.2%蔗糖的0.0IM的1 mM磷酸盐缓冲液，150yL待测样品在微孔板中反应5min，随后将胶体金试纸条插入微孔板中，反应1min后判读。判读依据:阳性样品:质控线、检测线同时有颜色。阴性样品:质控线有颜色，检测线无颜色。具体检测结果如图2所示。测试结果说明李斯特菌属胶体金试纸条及单增李斯特菌试纸条可以识别李斯特菌及单增李斯特菌的P60蛋白。
[0037]实施例4湿法检测李斯特菌属或单增李斯特菌
采用李斯特菌属胶体金试纸条检测时，将培养的李斯特菌菌液用1mM PBS稀释到17CFU/mL、5X106 CFU/mL、16 CFU/mL、5X105 CFU/mL、15 CFU/mL、5X104 CFU/mL、14 CFU/mL、13 CFU/mL并用空白PBS做对照。检测过程同实施例3，测试表明李斯特菌属胶体金试纸条与测试的12株李斯特菌属细菌均有交叉反应，结果具体如图3所示。
[0038]采用单增李斯特菌胶体金试纸条检测时，先将待测样品的培养液用5000g、10min进行离心，将上清用1mM PBS梯度稀释3倍、9倍、27倍并用未稀释的空白培养液做对照，检测过程同实施例3，测试表明单增李斯特菌胶体金试纸条与测试的8株单增李斯特菌的培养上清(18h培养)均有交叉反应，而与4株李斯特菌没有交叉反应，可检测的稀释倍数在3-27倍，结果具体如图4-1、4-2所示。
[0039]所述李斯特菌属包括4种李斯特菌和8种单增李斯特菌。所述8种单增李斯特菌为:ATCC 19111(l/2a)、ATCC 19115 (4b)、ATCC 19118(4e)、CMCC 54002(l/2c)、CMCC 54003、CMCC 54004^CMCC 54007和冻牛肉分离株；所述4种李斯特菌为:ATCC 19119(Listeriaivanovii)、ATCC 33090(Listeria innocua, 6a)、ATCC 35897(Listeria welshimeri,6b)和ATCC 25400(Listeria grayi)0
[0040]实施例5交叉反应实验
测试食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条与革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、大肠杆菌0157、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌的交叉反应。
[0041 ]测试食品中李斯特菌属胶体金试纸条交叉时，用所测试细菌菌液进行，测试浓度为5 X 18 CFU/mL。检测过程同实施例3，结果表明仅与测试的12株李斯特菌属细菌有反应，而与其它测试细菌无交叉，具体如图5-1所示。
[0042]测试食品中单增李斯特菌属胶体金试纸条交叉时，用所测试细菌培养上清进行(不稀释)。没有交叉反应。检测过程同实施例3，结果表明仅与测试的8株单增李斯特菌有反应，而与4株李斯特菌以及其它测试细菌无交叉，具体如图5-2所示。
【主权项】
1.基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条，其特征在于:包括吸水垫(I)、硝酸纤维素膜(2)、质控线(3)、检测线(4)、样品垫(5)和PVC底板(7);另配有金标抗体(6); 在PVC底板(7)上依次设置样品垫(5)、硝酸纤维素膜(2)和吸水垫(I);硝酸纤维素膜(2)直接设置于PVC底板(7)上;样品垫(5)—端搭接于硝酸纤维素膜(2)上，另一端直接设置于PVC底板(7)上;吸水垫(I)一端设置于PVC底板(7)上，另一端搭接于硝酸纤维素膜(2)上； 所述硝酸纤维素膜(2)上依次设有质控线(3)和检测线(4);所述质控线(3)上包被羊抗鼠IgG 二抗，检测线(4)上包被检测抗体2G7 ； 当基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属时，所述金标抗体(6)为抗体2H8的胶体金溶液；当基于单克隆抗体的检测食品中单增李斯特菌时，金标抗体(6)为抗体A号的胶体金溶液。2.权利要求1所述基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于步骤为: (I)金标抗体(6)的制备: a、胶体金溶液的合成:采用柠檬酸还原法合成30nm的金纳米粒子，在洗净的烧瓶中加入300mL质量浓度0.01%的氯金酸溶液，在磁力搅拌下加热至完全沸腾，向溶液中快速加入.4.8mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，将溶液煮沸1min直至颜色变为透亮的酒红色，将烧瓶置于室温冷却，并在4°C保藏； b、金标抗体的偶联:分别采用抗体2H8或抗体A号标记胶体金颗粒，具体过程为:用0.1M碳酸钾溶液将ImL步骤a制备的胶体金溶液调pH至7.5;加入单克隆抗体2H8或抗体A号1yg并在室温下反应2h;随后，加入50yL质量体积比为10%的牛血清白蛋白BSA的超纯水溶液，室温下继续反应2 h;4°C、6000g、20min条件下离心胶体金溶液，去除未偶联的BSA和单克隆抗体；用含有质量浓度为0.1%的NaN3、0.2% Tween,0.2%蔗糖的0.0lM的1mM磷酸盐缓冲液重悬金标抗体，4°C保藏，即得抗体2H8胶体金溶液或抗体A号胶体金溶液； (Π)胶体金试纸条的制备:将硝酸纤维素膜(2)固定于PVC底板上(7)上，将吸水垫(I)粘附在硝酸纤维素膜(2)与PVC底板(7)靠近质控线(3)的一端，将样品垫(5)粘附在硝酸纤维素膜⑵与PVC底板(7)的靠近检测线(4)的另一端;将检测抗体2G7稀释到lmg/mL，用喷膜机喷至检测线(4)处;将0.5 mg/mL的羊抗鼠IgG二抗喷至质控线(3)处，37°C烘干2h，即制得基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条。3.权利要求1所述基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条的应用，其特征在于:当金标抗体为抗体2H8时，用于特异性检测食品中李斯特菌属；当金标抗体为抗体A号时，用于特异性检测食品中单增李斯特菌。4.根据权利要求3所述基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条的应用，其特征在于:所述李斯特菌属包括4种李斯特菌和8种单增李斯特菌。5.根据权利要求4所述基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属和单增李斯特菌的胶体金试纸条的应用，其特征在于: 所述8种单增李斯特菌为:ATCC 19111(l/2a)、ATCC 19115 (4b)、ATCC 19118(4e)、CMCC 54002(l/2c)、CMCC 54003^CMCC 54004^CMCC 54007和冻牛肉分离株； 所述4种李斯特菌为:ATCC 19119(Listeria i vanovi i )、ATCC 33090(Listeriainnocua, 6a)、ATCC 35897(Listeria welshimeri, 6b)和ATCC 25400(Listeria grayi)。6.根据权利要求3所述基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属或单增李斯特菌的胶体金试纸条的应用，其特征在于具体步骤为: 取7yL金标抗体(6)与47yL重悬液，即含质量浓度为0.2% Tween、0.2%蔗糖的0.0lM的.10 mM磷酸盐缓冲液，150yL待测样品在微孔板中反应5min，随后将胶体金试纸条插入微孔板中，在层析作用下，与金标抗体结合的目标物，即李斯特菌属或单增李斯特菌P60蛋白，从样品垫(5)与检测线(4)上捕获抗体，与质控线(3)上的羊抗鼠IgG 二抗反应，从而在质控线(3)和检测线(4)上出现红色；1min后通过肉眼对结果进行判读，质控线(3)和检测线(4)同时出现红色即为阳性，检测线(4)不显色而质控线(3)出现红色即为阴性。
【文档编号】G01N33/577GK106093410SQ201610396890
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日 公开号201610396890.1, CN 106093410 A, CN 106093410A, CN 201610396890, CN-A-106093410, CN106093410 A, CN106093410A, CN201610396890, CN201610396890.1
【发明人】胥传来, 王文彬, 匡华, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 吴晓玲, 宋珊珊, 胡拥明
【申请人】江南大学