MiR?30a/HP1γ作为结直肠癌的诊断标志物的应用
【专利摘要】本发明涉及分子生物学和肿瘤药学领域。涉及miR?30a及HP1γ蛋白在结直肠癌诊断中的用途，以及miR?30a和HP1γ作为标志物用于结直肠癌的检测方法。本发明运用Real?timePCR、免疫组化(IHC)技术和蛋白印迹分析等方法检测结直肠癌病人肿瘤组织及其配对的正常组织中的miR?30a和HP1γ的表达水平。结果表明miR?30a在结直肠癌组织中显著低于其配对的正常组织；而HP1γ在结直肠癌组织中表达明显高于其配对的正常组织,并且miR?30a能特异性调节HP1γ蛋白的表达。由于HP1γ的表达水平与结直肠癌患者的肿瘤分化程度和术后生存率之间均呈显著负相关，本发明表明miR?30a/HP1γ能同时作为结直肠癌临床诊断的潜在标志物。
【专利说明】M i R-30a/HP1 γ作为结直肠癌的诊断标志物的应用
[0001] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的讲授内容之后，本领域技术人员可以对 本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
技术领域
[0002] 本发明涉及生物科学领域，更具体地说，涉及癌症诊断领域。特别是，本发明涉及 利用miR-30a(Hsa-miR-30a_5p)和其革巴基因 ΗΡ1 γ (Heterochromatin Protein lHomolog Gamma，Q13185-CBX3_HUMAN)共同作为结直肠癌诊断的肿瘤标志物，即通过检测miR-30a/ HP1 γ双表达水平来区分癌变细胞和正常细胞。
【背景技术】
[0003] 结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其发病率一直呈上升趋势，在全球恶性肿 瘤发病率中已上升至第三位，其死亡率居恶性肿瘤第二位。近些年来全球每年有一百多万 人死于结直肠癌。由于结直肠癌的发生与生活习惯，特别是饮食习惯密切相关，因此近年随 着我国人民生活水平的逐渐提高，结直肠癌的发病率和致死率在我国飞速增长。在我国，早 期发现结直肠癌患者诊断率不足10%。目前诊断结直肠癌的"金标准"是结肠镜，目前公认， 年龄大于50岁的人均应该接受结肠镜筛查。美国以及欧洲等权威部门指，对于具有家族性 高发病史或由于个人习惯患病风险高的人来说肠镜筛查尤为重要。但是我国目前还不上具 备在体检中广泛进行肠镜检测的条件，受试者的痛苦也不言而喻，所以广泛推行结肠镜检 测并不现实。
[0004] 迄今为止，全球的结直肠癌筛查方案尚不成熟。人们已经确定了一些存在于结直 肠组织、粪便或血清中的生物标记物，如癌胚抗原(CEA)等，来用于结肠癌的早期诊断和预 测。目前，CEA是临床上唯一一个推荐用于结直肠癌患者诊断及预后判断的分子标志物，远 远不能满足临床需求，因此亟待寻找更多结直肠癌相关肿瘤标志物。最近还报道了一些组 织、粪便和血清中的结直肠癌分子标记物，但其效果也远低于结肠镜。例如用粪便DNA特异 地甲基化位点作为标记，当特异度达到90%时，灵敏度只有50%。每年大约报道上千种肿瘤 分子标记物，但是最后应用于临床的分子标志物廖廖无几。早期的筛查和诊断已经成为结 直肠癌防治急需解决的重大科学问题。肿瘤标志物的发现和合理应用是肿瘤早期发现、早 期诊断的前提。然而，目前对于有关结直肠癌的发病机制和特性的认识仍然不足。因此，开 发新的结直肠癌早期诊断和治疗策略成为当务之急。
[0005] 迄今为止，尚未发现可供临床应用的、能有效地早期筛查和诊断结直肠的检测试 剂。本发明以miR-30a/HPl γ作为标志物用于结直肠癌的检测试剂及方法，将为早期发现和 诊断结直肠癌，以及为肿瘤患者提供可靠的辅助治疗方案具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供miR-30a/HPl γ的新用途。本发明提供了miR-30a/HPl γ作为 结直肠癌辅助诊断标志物的用途，以及使用miR-30a/HPl γ为靶标筛选抑制结直肠癌细胞 增殖和侵袭的药物，为结直肠癌的诊断和治疗提供参考依据。本发明采用Real-time PCR， Western Blot和免疫组化技术对结直肠癌病人的肿瘤标本与正常组织中miR-30a/HPl γ的 表达水平进行分析，发现miR-30a的表达水平在结直肠癌组织中显著低于其配对的正常组 织，而ΗΡΙγ在结直肠癌组织中显著高于其配对的正常组织并且其蛋白质表达水平直接受 miR-30a调控，表明miR-30a/HPl γ能够作为结直肠癌的一种辅助诊断标志物。
[0007] 本发明的技术方案主要包括如下内容：
[0008] 一种与癌细胞或肿瘤辅助诊断相关的标志物，该标志物为miR-30a和ΗΡ1 γ中的任 意一种或两种，所述的ΗΡ1 γ为ΗΡ1 γ基因或/和ΗΡ1 γ蛋白。该标志物优选为miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白的组合。
[0009] miR-30a和ΗΡ1 γ中的任意一种或两种在作为癌细胞或肿瘤辅助诊断标志物中的 应用。优选为miR_30a和ΗΡ1 γ蛋白在作为癌细胞或肿瘤辅助诊断标志物中的应用。
[0010] 上述的标志物在制备癌细胞或肿瘤辅助诊断试剂盒中的应用。
[0011] -种用于检测miR_30a表达水平的试剂盒或生物芯片，该试剂盒或生物芯片中包 括用于检测血液或肿瘤组织中的miR-30a表达水平的特异性引物。
[0012] 一种用于检测ΗΡΙγ蛋白表达水平的试剂盒，该试剂盒中包括用于检测血液或肿 瘤组织中的ΗΡ1 γ蛋白表达水平的特异性抗体。
[0013] -种癌细胞或肿瘤辅助诊断试剂盒或生物芯片，该试剂盒或生物芯片用于检测血 液或肿瘤组织中的miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白mRNA的双表达水平。上述的癌细胞或肿瘤辅助诊断 试剂盒或生物芯片，该试剂盒或生物芯片含有用于检测miR_30a表达水平和HP1 γ蛋白mRNA 的特异性引物和用于检测HP1 γ蛋白表达水平的特异性抗体。
[0014] 上述的癌细胞或肿瘤辅助诊断试剂盒或生物芯片，该试剂盒中还包括PCR技术常 用的试剂和免疫组化技术常用的试剂。
[0015] -种在癌细胞或肿瘤中高表达的ΗΡ1 γ蛋白的活性、作用、及表达量的抑制物，该 抑制物为ΗΡ1 γ基因及其蛋白产物的抑制物，优选的该抑制物为包括抗体、化学抑制物、和 miRNA抑制物以及类似物中的至少一种。所述的miRNA抑制物为miR-30a以及类似物，优选为 miR-30a〇
[0016] miR-30a在制备抑制癌细胞或肿瘤药物中的应用。
[0017] 所述的癌细胞包括结直肠癌细胞及其他类似的上皮癌细胞;所述的肿瘤包括肠癌 及其他上皮肿瘤。所述的上皮肿瘤包括肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌。
[0018] 上述技术方案中，miR-30a和HP1 γ蛋白表达水平的检测分析过程分别包括以下步 骤：
[0019] l)miR-30a表达水平的检测分析
[0020] a)收集结直肠癌病人的新鲜肿瘤组织标本，提取总RNA
[0021] b)Real-time PCR检测miR-30a表达水平
[0022] c)miR-30a与HP1 γ蛋白表达相关性分析
[0023] 2)ΗΡ1 γ蛋白表达水平的检测分析
[0024] a)收集结直肠癌病理标本，提取总蛋白
[0025] b)使用特异的HP1 γ抗体进行Western blot实验，测定HP1 γ蛋白的表达水平
[0026] c)收集癌症病人的石腊切片
[0027] d)免疫组织化学染色（IHC)检测分析HP1 γ蛋白表达情况。
[0028] 采用本发明所述的标志物确定受检细胞是癌细胞还是正常细胞的检测方法，同时 检测病人血液或肿瘤组织中miR-30a(Hsa-miR-30a_5p)和ΗΡ1 γ蛋白（Heterochromatin Protein lHomolog Gamma，Q 13185-CBX3_HUMAN)的表达情况。如果病人样品中ΗΡΙγ 蛋白 水平升高且miR_30a水平低于正常组织对照，则可初步判定此病人患有肿瘤。
[0029] 所述的癌细胞包括了结直肠癌细胞及其他类似的上皮癌细胞（epithelial cancer cell)。
[0030] 所述的肿瘤组织包括：肠癌及其他上皮肿瘤如肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌 等。
[0031] 包括利用PCR技术、微阵列芯片、测序技术及免疫组化技术对miR-30a和HP1 γ蛋白 质的表达水平进行分析以确定病人样品中细胞癌变信息的方法。
[0032]本发明发现一种能抑制本发明所鉴定出的在结直肠癌中高表达的ΗΡ1 γ蛋白 (Heterochromatin Protein lHomolog Gamma，Q13185_CBX3_HUMAN)的活性、作用、及表达 量的方法，以及由此产生的新的结直肠癌或其他上皮肿瘤的诊断和治疗方案。其中包括HP1 γ基因及其蛋白产物的抑制物，包括:抗体、化学抑制物、和miRNA抑制物以及类似物。其中， 所述的miRNA抑制物包括本发明所鉴定出的与结直肠癌相关的miR-30a(Hsa-miR-30a-5p) 以及类似物。
[0033]本发明的实验结果用独立实验的平均值和标准差表示，用双侧t检验来比较差异。 P〈0.05认为具有统计学差异，P〈0.01为显著性差异。所有数据采用SPSS V13.0软件或者具 备类似统计功能的软件分析。
[0034]本发明的有益效果：
[0035]本发明提供了一种快速简便的结直肠癌辅助诊断标记物(miR-30a/HPl γ )的检测 方法，可以作为结直肠癌诊断的辅助指标。
【附图说明】
[0036] 图1 Western Blot实验检测结直肠癌病人肿瘤组织及配对的正常组织的ΗΡΙγ蛋 白表达水平
[0037]图2 ΗΡΙγ在结直肠癌临床病理标本中表达分析 [0038]图3 miR_30a在结直肠癌组织中表达情况及相关性分析
[0039] 图4 HP1 γ为miR-30a下游靶基因 [0040]图5 miR-30a抑制结直肠癌细胞增殖与克隆形成能力 [0041 ] 图6 miR_30a在体内抑制结直肠癌细胞生长
【具体实施方式】
[0042]本发明人经过广泛的研究，发现miR-30a和HP1 γ在结直肠癌组织中存在异常表 达，并且二者呈现负相关的关系，从而提示miR-30a和ΗΡΙγ在结直肠癌发生和发展过程中 起到较为重要的作用。miR-30a/HPl γ可以同时作为结直肠癌的一种诊断标志物，有助于结 直肠癌的早期诊断、靶向治疗和临床预后。
[0043]本发明具体实施例中所涉及的试剂除特别说明外，均为本领域技术人员公知的常 规试剂。本发明中所述的室温为25 ± 5°C。
[0044] [1]ΗΡ1 γ蛋白水平的检测：
[0045] 采用Western blot技术检测ΗΡΙγ蛋白在结直肠癌组织和相应的正常组织中的表 达情况。图l(A)Western blot检测ΗΡ1 γ蛋白在结直肠癌新鲜组织标本中的表达情况(η = 38)，每一例包括结直肠癌组织和匹配的正常组织。GAPDH作为内参。图1(B)用Image J软件 对Western blot图进行灰度分析，并以HP1 γ/GATOH值作为纵坐标，比较结直肠癌(CRC)和 正常组织(NAT)中HP1 γ表达情况，Western blot实验结果表明HP1 γ蛋白在结直肠癌组织 中显著高于其配对的正常组织(Ρ〈〇.01)。
[0046]具体实施步骤如下：
[0047] 1)收集病人的肿瘤组织及配对的正常组织，剪成小块用液氮研磨，加 lmL RAPI蛋 白裂解液裂解细胞，然后将裂解液移入到1.5mL离心管，冰上裂解30分钟。
[0048] 2)14000印111，4°(：，10分钟，收集蛋白上清，-20°(：保存。
[0049] 3)用BSA法测定蛋白质浓度。
[0050] 4)取相同质量的蛋白量(体积X蛋白质浓度），并加入5 X电泳加样缓冲液。
[0051] 5)10(TC 煮样 5 分钟。
[0052] 6)上样，电泳。90V，大约15-20分钟，样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶后，电压调 至120V，电流过程中保持电压恒定。当溴酚蓝指示剂迀移至距前沿l-2cm处即停止电泳，约 1-2小时。15%的分离胶和5%的浓缩胶的配方见表1。
[0053]表1 15%的分离胶和5%的浓缩胶：
[0054]
[0055] 7)电转膜仪转膜(24V 35分钟）
[0056] 8)牛奶封闭。5%牛奶(5g奶粉+100mL PBST)，室温，摇床上封闭1小时。
[0057] 9)孵育HP1 γ 蛋白一抗（l/1000;Millipore，#05-690)及GAPDH内参一抗（1/20000; MBL，#M171-3)，4°C，过夜。
[0058] 10) PBST漂洗，4次，每次10分钟，室温摇床。
[0059] 11)孵育与一抗相对应种属的二抗(1/50000; Sigma，#A2304)，室温摇床2小时。
[0060] 12) PBST漂洗，4次，每次10分钟，室温摇床。
[00611 13)加 ECA发光液反应1-2分钟，显影，定影，观察结果。
[0062] [2]ΗΡ1 γ蛋白免疫组化分析
[0063]图2(A)免疫组织化学染色（IHC)检测ΗΡΙγ蛋白在正常组织、高分化、中分化和低 分化结肠癌组织中的表达情况，结果显示在结直肠癌组织中ΗΡ1 γ蛋白表达水平显著高于 正常组织(11=178，？〈0.001)。图2(8)即1丫在结直肠癌组织中的表达显著高于正常组织。数 据表示为16&11±50，***?〈0.001(11=178) ;图2(〇冊1丫蛋白在正常(11 = 178)、高分化(11 = 18)、中分化(η=122)和低分化(η = 38)结直肠癌中的表达情况，并且发现ΗΡΙγ表达与肿瘤 分化程度呈负相关（？〈0.05)。数据表示为1^311±50，冲〈0.01，*冲〈0.01 ;图2(0)1^口1&11-Meier 法分析 ΗΡΙγ 高表达组（High ΗΡΙγ expression，n = 82)与低表达组（Low ΗΡΙγ expression，η = 91)临床预后之间的关系(Log Rank，Ρ = 0.001)。结果显示，ΗΡ1 γ的表达水 平与结直肠癌患者的生存率之间呈负相关，在统计学上有非常显著的差异(Ρ = 〇.001)。 [0064] 免疫组化主要试剂：
[0065]即用型高效免疫组化试剂盒产品编号为UNIV-IHC-0001，包括试剂Α:内源性过氧 化酶阻断剂(Endogenous peroxidase blocking solution);试剂Β:超级封闭液；试剂C:一 抗放大剂;试剂D:酶标二抗聚合物;DAB显色剂：即用即配。枸橼酸钠抗原修复液(pH 6.0)、 0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7.4)购自武汉博士德生物工程有限公司；苏木精，树脂封 片剂，硅化载玻片，盖玻片;30 %酒精，50 %酒精，70 %和90 %酒精，无水酒精，二甲苯均等。 [0066]具体实施步骤如下：
[0067] 1)180例随访5~8年的人类结直肠癌组织样本芯片来自于上海国家工程研究中心 生物样本库。所有病例手术时间为2006~2007年间，且术前均未经化学治疗或放射治疗， 180例患者中男性104例，女性76例，年龄24~90岁，平均年龄66岁；结肠癌和直肠癌各90例； 临床病理分期:结直肠癌I期18例，Π 期122例，ΙΠ 期38例，未提供病理信息2例，详细信息见 附表2。所有的组织标本取出后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋备用。 [0068]表2:结直肠癌标本临床病理参数统计
[0069]
[0071] 2)石蜡切片脱蜡至水:脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60°C恒温箱中 烘烤20分钟。二甲苯I 10分钟-二甲苯II 5分钟。酒精梯度：100%，5分钟-90%，5分钟- 70%，5分钟-50%，5分钟。PBS洗5分钟，3次。
[0072] 3)抗原修复:将切片置于10mM pH6.0柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，微波炉加热15分 钟。
[0073] 4)过氧化氢封闭内源性过氧化物酶:3 %H2〇2，室温10分钟，PBS洗5分钟，3次。
[0074] 5)正常血清封闭：擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分(保持组织呈湿 润状态），滴加正常山羊或兔或牛血清（1 %BSA，0.05g BSA+5ml PBS)(与第二抗体同源动物 血清），室温，1小时，PBS洗5分钟，3次。
[0075] 6)10%正常山羊血清室温封闭20分钟后加 HP1 γ蛋白一抗（1:500)，室温孵育1小 时，PBS洗5分钟，3次。
[0076] 7)加二抗(与一抗相对应），室温1小时（1:200)，PBS洗5分钟，3次。
[0077] 8 )DAB显色，终止后自来水冲洗，苏木素复染。
[0078] 9)梯度酒精脱水:50%乙醇1分钟-70%乙醇1分钟-90%乙醇1分钟-100%乙醇 1分钟。二甲苯透明：二甲苯I和Π 按序各5分钟。
[0079] 10)中性树脂封片，显微镜下观察HP1 γ蛋白水平。
[0080] 11)结果判定:在光学显微镜下，胞浆或胞核出现棕黄颗粒为阳性细胞。免疫组化 阳性反应的分级采用兼顾阳性细胞染色强度和阳性细胞所占百分比的判断标准。具体方法 为每张切片随机取5个高倍视野，尽量避开边缘区。用微微测量网格计数所有细胞数以及阳 性细胞数，计算阳性细胞所占比例的平均值。按染色强度评分:无色为〇分，淡黄色为1分，棕 黄色为2分，棕褐色为3分;按阳性细胞所占百分比评分：阴性为0分，阳性细胞<10%为1分， 11 %~50%为2分，51 %~75%为3分，>75%为4分。染色强度与阳性百分比得分的乘积>3为 免疫阳性。并按乘积分数分为4个等级:一 (0，1，2); + (3,4);++(6,8);+++(9，12)。
[0081 ] [3]miR_30a在结直肠癌组织中表达情况及相关性分析
[0082] 我们利用Real-time PCR技术在38例结直肠癌组织和相应的正常组织中检测了 miR-30a表达情况。数据显示为Mean 土 SD，独立实验重复3次，采用独立样本t检验方法。结果 表明miR-30a在结直肠癌组织中表达显著低于其配对的正常组织（图3A和B)，*P〈0.05，**P〈 0.01;图3(C)38对结直肠癌组织标本中miR-30a表达水平与HP1 γ蛋白表达水平相关性分析 (R = -0.5981，#Ρ〈0.01)，miR-30a表达水平与ΗΡ1 γ蛋白表达水平呈显著负相关。
[0083]具体实施步骤如下：
[0084] 3.1收集结直肠癌病人的新鲜肿瘤组织标本，提取总RNA
[0085] 38例新鲜结直肠癌组织标本从江苏省中医院（南京中医药大学附属医院）收集，每 例包括肿瘤组织和相应的癌旁组织，采集前均通过江苏省中医院伦理委员会批准及患者知 情同意。所有标本均经病理诊断确诊为结直肠癌，所有患者未接受放化疗治疗。收集病人的 肿瘤组织及配对的正常组织，液氮保存备用。
[0086] 采用QIAGEN公司的miRN^;asy?Minikit(cat·no·217004)可以提取纯化含有 miRNA的总RNA，详细步骤如下：
[0087] 1)加 700yLQIAzol Lysis试剂到细胞样品中充分裂解，如果是临床组织样本需要 先在研钵中边加液氮边研磨，待组织样本磨成粉末后加入QIAzol Lysis继续研磨，再将研 磨液吸入到1.5mL去RNA酶EP中，室温静置5min;
[0088] 2)加入140yL三氯甲烷(氯仿），旋涡振荡15s，室温静2~3min;
[0089] 3)4°C，12000Xg 离心 15min;
[0090] 4)小心吸取离心后上清至一个新收集管中，加入1.5倍体积的100 %乙醇，吹打混 匀；
[0091] 5)将RNeasy?Mini柱放入一个2mL收集管中，吸取700yL混合液至RNeasy?:Mini柱 中，室温彡8000 X g离心15s，弃过滤液；
[0092] 6)重复上面步骤直至混合液全部离心完；
[0093] 7)加入700yL RWT buffer至RNeas:y?Mini柱中，室温彡8000Xg离心 15s，弃过滤 液；
[0094] 8)加入500yL RPE buffer至RNeasy?Mini柱中，室温彡8000Xg离心 15s，弃过滤 液；
[0095] 9)加入500yL RPE buffer至R.Ncasy?Mini柱中，室温^8000Xg离心2min，弃过滤 液；
[0096] 10)将RNeasy?Mini柱放到一个新的1.5mL收集管中，吸取30~50yL RNA-free H2O至RNeasy?Mini柱中央膜上，室温彡8000 X g离心lmin;
[0097] 如果希望得到更多产量的RNA，可重复步骤（10)，再吸取30~50yL RNA-free H20 至RNeasyiJMini柱中央膜上，离心得到总RNA样品。
[0098] 3.2 miRNA逆转录
[0099]米用GenePharma公司的Haripin-itTM microRNA and U6snRNA Normalization Real-time PCR Quantitation Kit，以l_3yg总RNA为逆转录模板，使用带有莖环结构的特 异性引物将miRNA逆转录为cDNA。逆转录所得的cDNA产物用ddH20稀释至200yL，再作为模板 用于下一步Real-time PCR(miR-30a及U6逆转录引物及检测引物均由上海吉玛制药技术有 限公司设计并合成）。逆转录体系见表3。
[0100] 表3逆转录体系：
[0101]
[0102] 标准逆转录反应程序：
[0103] Step l：25〇C,30min
[0104] Step 2：42〇C,30min
[0105] Step 3：85〇C,5min
[0106] 4Γ，保存。
[0107] 3.3 Real-time定量检测miR_30a表达水平
[0108] 反应体系见表4
[0109] 表4反应体系：
[0110]
[0111] 实时定量PCR反应程序：
[0112] Step l：95〇C,3min
[0113] Step 2:95Γ，128;62Γ，40s(40循环）
[0114] [4]ΗΡ1 γ 为miR-30a下游靶基因
[0115] TargetScan(http://www. targetscan. org/),PicTar(http://pictar.mdc- berlin · de/)和miRDB(http: //www .mirbase · org/)是目前使用率最高，并且公认的miRNA革巴 基因预测信息较完善，相对比较准确的预测软件。生物信息学预测软件显示在HP1 γ的3'-UTR 区域存在 miR-30 家族(包括 111丨1?-3(^、111丨1?-3013、111丨1?-30(3、111丨1?-30(1和111丨1?-3〇6)的结合位点 (图4A)，并且该结合位点区域具有特种保守性。此外miR-30家族所有成员具有相同的种子 区域(Seed sequence)，均结合在HP1 y3'_UTR区域上。荧光素酶报告基因实验检测了miR-30家族是否可以通过结合在HP1 γ 3'-UTR区域从而负调控HP1 γ的表达。结果显示，miR-30a/b/c/d/e分别与克隆了HP1 γ 3'-UTR的pMIR-REPORT? Luciferase质粒和共转染HCT116 细胞之后，与阴性对照相比，荧光强度均受到不同程度的抑制（图4B)，但miR-30a的抑制效 果最强(？〈0.01)。然而，将11^1?-30 &结合位点碱基突变以后，这种抑制效果几乎消失（图4〇 (P>0.05)。在Western blot实验中，miR-30a转染细胞后，HP1 γ蛋白水平明显受到抑制，表 明ΗΡ1 γ是miR-30a直接作用的下游靶基因（图4D&E)。
[0116]具体实施步骤如下：
[0117] 4.1荧光素酶报告基因载体构建
[0118] 4.1.1引物设计
[0119] 根据生物信息预测（表5)，找到HPly3'UTR上与miR-30家族结合片段的序列。HP1 Y3'UTR片段序列如下：
[0121] 表5 TargetScan软件预测miR-30家族与HP1 γ的结合位点
[0122]
[0123] 根据上述序列，在Primer 5.0中设计PCR扩增引物：
[0124] Sense:5 '-TCTTTACCCCAATTCATTACATGGAGGC-3 '
[0125] Antisense:5 '-TTTCTATTTCTACTGTAAAGGCATATCA-3 '
[0126] 分别加上(Spe I和Hind III)酶切位点和保护碱基：
[0127] Sense:5 '-CGGACTAGTTCTTTACCCCAATTCATTACATGGAGGC-3 '
[0128] Antisense:5 '-CCCAAGCTTTTTCTATTTCTACTGTAAAGGCATATCA-3 '
[0129]引物设计完成后，经过http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/在线比对确认，由南京 金斯瑞生物公司合成。
[0130] 4.1.2 PCR扩增
[0131] 表6标准PCR反应体系：
[0132]
[0133] 标准PCR反应程序：
[0134] Step 1:95 °C，5min
[0135] Step 2:98Γ，1〇8;55Γ 30s;72°C 20s(35个循环）
[0136] Step 3：72〇Ca〇min
[0137] 4°C，保存。
[0138] 4.1.3琼脂糖凝胶电泳
[0139 ] 1)洗净琼脂糖凝胶电泳槽、梳子，配制1 X TAE电泳缓冲液；
[0140] 2)将配置好的2%琼脂糖凝胶插上梳子，室温下放置30~45min，直至凝胶完全凝 结；
[0141 ] 3)小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中；
[0142] 4)向电泳槽中加入1 X TAE电泳缓冲液，刚好没过凝胶；
[0143] 5)将 10XLoading buffer与PCR产物混合均匀；
[0144] 6)将上述混合液加至上样孔中；
[0145] 7)关上电泳槽盖，接好电源，电压90V，使DNA从负极(黑）向正极(红)方向移动；
[0146] 8)当溴酚蓝向前移动至胶的2/3时，关闭电源，拔出电极插头，打开电泳槽盖。
[0147] 4.1.4 DNA产物胶回收
[0148] 1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量；
[0149] 2)加3个凝胶体积的Buffer DE-A，75°C加热，间断混合，直至凝胶块完全熔化(约6 ~8min);
[0150] 3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均勾。当分离的DNA片段小于 400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇；
[0151] 4)吸取上一步中的混合液，转移到DNA制备管（置于2mL离心管）中，13000rpm， lmin，弃滤液；
[0152] 5)将制备管置回2mL离心管，加500yL Buffer ￥1，13000印111，3〇8，弃滤液；
[0153] 6)将制备管置回2mL离心管，加700yL Buffer 12，13000印111，3〇8，弃滤液，重复一 次；
[0154] 7)将制备管置于2mL离心管中，13000rpm，离心2min;
[0155] 8)将制备管置于新的1.5mL离心管中，加25~60yL去离子水，室温静置5min;
[0156] 9) 13000rpm，lmin，洗脱 DNA，-20 °C 保存备用。
[0157] 4.1.5目的片段和报告基因载体双酶切
[0158] 表7双酶切反应体系：
[0159]
[0160] 37°C水浴3h，琼脂糖凝胶电泳对DNA片段和pMIR-REPORTTM Luciferase载体双酶 切产物进行回收纯化。
[0161] 4.1.6 DNA片段与载体连接
[0162] 表8 DNA片段与载体连接反应体系
[0163]
[0164] DNA片段与载体分子数目比为1:10~1: 3。16°(：连接过夜。
[0165] 4.1.7细菌转化
[0166] 1)取出感受态细菌DH5a，冰上融化；
[0167] 2)加入5~20yL连接产物至感受态细菌DH5a中，轻轻混匀，冰上放置30min;
[0168] 3)42°(：热激9〇8，然后迅速冰浴21^11;
[0169] 4)加 lmL的LB培养液，37°C摇床中培养45min;
[0170] 5)将菌液均匀涂布于含有抗生素的LB平板上；
[0171] 6)37°C培养箱中培养12~16h，直至长出肉眼可见菌落时挑取单克隆扩大培养并 鉴定。
[0172] 4.1.8质粒提取
[ΟΙ73 ] 1)收集5~15mL过夜培养的菌液，8000rpm，离心lmin，弃上清；
[0174] 2)加入500yL Buffer P1(含RNase A)，涡旋振荡悬浮细菌沉淀；
[0175] 3)加入500yL Buffer P2,温和混匀，室温放置3~5min;
[0176] 4)加入500yL Buffer E3,立即混匀，室温放置5min;
[0177] 5)13000rpm，离心 lOmin;
[0178] 6)将上清加入Endo-Remover Column中（已装入收集管），13000rpm，离心lmin;
[0179] 7)将收集管中的滤液转移到新的离心管中，加入450yL异丙醇，上下颠倒混匀；
[0180] 8)柱平衡：向已装入收集管的Spin Column DL中加入200yL Buffer PS， 13000rpm，离心lmin，倒掉收集管中的废液，将Spin Column DL重新放回收集管中；
[0181] 9)将步骤7)中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱（已装入收集管） 中；
[0182 ] 10) 13000rpm，离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0183] 11)加入750yL Buffer PW，13000rpm，离心lmin，倒掉收集管中的废液；
[0184] 12)将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm，离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室 温干燥5min;
[0185] 13)将吸附柱置于一个新的离心管中，加入100~200yL去离子水，室温放置5min， 13000rpm，离心2min，-20 °C 保存备用。
[0186] 4.1.9目的片段鉴定
[0187] 将上述质粒应用相应的限制性双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，初步查 看条带是否与目的片段大小一致，并将样本送至上海英骏生物技术有限公司进行测序分 析，进一步确定克隆进载体的片段是否为目的片段以及是否有碱基突变。
[0188] 4.2 miRNA结合位点碱基突变
[0189] 我们使用Muta-direct?定点突变试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司）可以在 质粒DNA序列的特定位点诱导碱基突变。
[0190] 4.2.1设计点突变引物
[0191] 1)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置；
[0192] 2)计算引物的Tm值，看是否达到78°C，如果Tm值低于78°C，则适当改变引物的长度 以使其Tm值达到78°C(GC含量应大于40%);
[0193] 3)使用经过纯化的引物；
[0194] !'111值计算公式：1'111 = 0.41\(%(^6〇-675/1+81.5
[0195] 其中：L:引物碱基数；％of GC:引物GC含量。
[0196] 4.2.2样品PCR反应体系
[0197] 表9样品PCR反应体系：
[0199] 4.2.3 PCR反应条件
[0200] Step 1:95 °C，3s
[0201] Step 2:95°C，lmin; 72°C，lmin per plasmid KB(突变 1-2个喊基 15循环，突变3个 碱基18个循环）
[0202] PCR扩增反应完成后冰上孵育5min，然后置于室温。
[0203] 4.2.4突变质粒选择
[0204] PCR反应结束后使用Mutazyme?酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。
[0205] 1)准备PCR反应产物；
[0206] 2)加入 lyL(10UAiL)Mutazyme? 酶 37°C 温育 1 小时；
[0207] 当质粒DNA用量过多时Mutazyme?酶可能发生与样品反应不完全的现象。为了保证 突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加 Mutazyme?酶用量。
[0208] 4.2.5 转化
[0209] 反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时选择dam+ 型菌株，例如DH5a。
[0210] 1)将l〇yL样品加到50yL感受态细胞里，然后放置在冰上30min;
[0211] 2)接下来可以参照一般的转化步骤进行。
[0212] 4.3荧光素酶报告基因实验
[0213] 1)转染前一天，将生长良好的细胞接种于12孔板中，经16~18h后细胞融合度为 60%~70%左右；
[0214] 2)转染前吸干培养基，换成新鲜培养基(不含血清和抗生素）。每孔0.8yg单荧光素 酶报告质料，〇. 2yg0-gal内参质粒，miR-30mimics或者NC对照lyL(母液为20μΜ)。质粒(yg) 与转染试剂(yL)之比为1:3。将上述质粒用100yL的无血清培养基混匀，室温放置15min后， 再依次加入到六孔板细胞中。37 °C细胞培养箱中培养。其中，每个样品设三个复孔；
[0215] 3)转染4~6小时后换成全培养基后继续培养；
[0216] 4)转染48小时后，吸去培养基，用roS洗两遍。先用胰酶消化几分钟后，用roS重悬 细胞后移入1.5mL的EP管中，lOOOrpm离心5min收集细胞，在细胞沉淀中加入100yL的RIPA细 胞裂解液，冰上裂解细胞30min;
[0217] 5)4°C，12000rpm离心 10min;
[0218] 6)取10yL上清用于荧光素酶的活性测量，加入40yL的Luciferase底物，迅速吸打 均匀后，测量荧光值；
[0219] 7)准备β-半乳糖甘酶的测活缓冲体系：
[0220] 表10 β-半乳糖甘酶的测活缓冲体系
[0221]
[0222] 37°C水浴反应37min，此时反应液为黄色，取150yL反应液通过酶标仪读取420nm的 光吸收值。然后用荧光素酶活性除以β-gal活性即可得到相对荧光素酶活性，进而分析 miRNA对靶基因的调控作用。
[0223] [5]miR_30a抑制结直肠癌细胞增殖和克隆形成能力
[0224] 为检测miR-30a对结直肠癌细胞增殖能力的影响，我们对转染了 miR-30a的HCT116 和SW620细胞用CCK-8和EdU法检测miR-30a对结直肠癌细胞增殖能力的影响，结果表明， miR-30a对HCT116和SW620细胞增殖能力有很明显的抑制效果，具有显著性差异(#P〈0.01 和*P〈0.05)(图5A和B)。说明miR-30a能够抑制HCT116和SW620细胞增殖。我们还研究了miR-30a过表达对结直肠癌细胞克隆形成能力影响的实验，实验结果显示miR-30a过表达后显著 降低了 HCT116细胞的克隆形成能力（图5C)。
[0225] 具体实施步骤如下：
[0226] 5.1 CCK-8法检测细胞增殖
[0227] 1)按miRNA转染步骤进行细胞转染，转染时间24~48h;
[0228] 2)弃培养基，PBS洗两次，胰酶消化细胞，加入含10%FBS的培养基终止消化；
[0229] 3)计数细胞，调整细胞密度至2X104个/mL，96孔培养板内每孔加入100yL细胞悬 液，即每孔接种2000个细胞，每组设3~5个平行孔，2个空白对照孔，共接种4块96孔培养板， 37 °C培养箱培养；
[0230] 4)每天同一时间取1块96孔板进行测量。每孔培养基中加入10yL CCK-8,混匀，37 °C培养lh;
[0231] 5)用酶标仪测定450nm吸光值；
[0232] 6)以不同处理组细胞的0D450值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞的生长曲 线。
[0233] 5.2 EdU法检测细胞增殖
[0234] 1)按miRNA转染步骤进行细胞转染，转染时间24~48h。消化细胞，计数，以每孔4 X 103~1 X 105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段；
[0235] 2)用细胞培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μΜ EdU培养 基；
[0236] 3)每孔加入100yL 50μΜ EdU培养基孵育2h，弃培养基；
[0237] 4)PBS清洗细胞1~2次，每次5min;
[0238] 5)每孔加入50yL细胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育30min，弃固定液；
[0239] 6)每孔加入50yL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5min后，弃甘氨酸溶液；
[0240] 7)每孔加入100yL PBS，脱色摇床清洗5min，弃PBS;
[0241] 8)(加强)每孔加入100yL渗透剂(0.5%Triton X-100的PBS)脱色摇床孵育lOmin; PBS 清洗1 次，5min;
[0242] 9)每孔加入100yL的IX Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃 染色反应液；
[0243] 10)加入100yL渗透剂（0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2~3次，每次 10min，弃渗透剂；
[0244] 11)(加强）每孔每次加入lOOyL甲醇清洗1~2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次 5min；
[0245] 12)用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量lXHoechst33342反应液，避 光保存；
[0246] 13)每孔加入100yL lXHoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min 后，弃染色反应液；
[0247] 14)每孔每次加入100yL PBS清洗1~3次；
[0248] 15)在荧光显微镜下截取图像，拍照。
[0249] 5.3平板克隆实验
[0250] 1)按miRNA转染步骤进行细胞转染，转染时间24~48h。胰酶消化细胞；
[0251] 2)收集细胞计数，六孔板每孔接种200个细胞，37°C培养14天左右；
[0252] 3)弃培养基，PBS洗1次，甲醇固定20min，弃去固定液，待稍干燥后加入0.1 %结晶 紫染色20min，用水洗去残余染液，计数细胞数在50个细胞以上的克隆。
[0253] [6]miR_30a在体内抑制结直肠癌细胞生长
[0254] 为了进一步研究miR_30a对肿瘤增殖的作用。我们在免疫缺陷的裸鼠中进行研究， 为了实验背景的一致性，我们采用同一只小鼠的两个后肢皮下分别接种miRNA-30a过表达 和NC对照细胞的方法。进而分析miR-30a能否在体内抑制肿瘤的生长。图6 (A)裸鼠左右侧分 别接种5 X 106个HCT116miR-NC与miR-30a过表达的稳定细胞株，20天后处死裸鼠并拍照，从 外观来看，在接种20天后，转染miR-30a的肠癌细胞成瘤体积比NC明显要小；图6(B)将移植 瘤取出拍照，mi R-30a过表达组(η = 8)与NC组(η = 8)相比体积明显变小。图6 (C)绘制mi R-30a过表达组与NC对照组肿瘤生长曲线，每4天测量一次肿瘤尺寸，共测量20天，**P〈0.01; 图6(D)将miR-30a过表达组(n = 8)与NC对照组(n = 8)肿瘤取出称重，比较两组肿瘤质量*** P<0.001；
[0255] 具体实施步骤如下：
[0256] 6.1 miR_30a过表达稳定细胞系构建
[0257] 1 )miRNA-30a 前体序列：
[0258] 链A:
[0259] (保护碱基)GCC(HpaI 保护碱基与酶切位点)GTTAACGCGACTGTAAACATCCTCGACTGGAA GCTGTGAAGCCAC AGATGGGCTTTCAGTCGGATGTTTGCAGCTGCTTTTTTG (终止子）
[0260] 链B:
[0261] (保护碱基)^(XhoI 保护碱基与酶切位点)GAGCTCCAAAAAAGCAGCTGCAAACATCCGAC TGAAAGCCCATCTGTGGCTTCACAGCTTCCAGTCGAGGATGTTTACAGTGC
[0262] 2)将链A和链B分别稀释成60μΜ的母液；
[0263] 3)将链Α和Β各取lyL，加入48yL退火buffer(100mM K-acetate，20mM HEPES-K0H pH 7 · 4，2mM Mg-acette)，95°C，4min; 70°C，lOmin，室温缓慢冷却20min，4Γ放置20min;
[0264] 4)如前步骤将miR_30a前体连接到pLL3.7载体上，转化、挑选阳性克隆，测序鉴定；
[0265] 5)若序列正确则可进行下一步的慢病毒制作。三种质粒按照以下比例转染293T细 胞：8.4yg pLL3.7-miR-30a，14yg pCMV-AR8.9,5.6yg pCMV-VSV-G，36~48小时后收集细 胞上清，用0.22μπι的滤器过滤，即得到用于干扰表达的慢病毒。用与逆转录病毒同样的方法 感染目标细胞，然后以GFP为标记进行流式筛选，所得细胞扩大培养，即可得到miR-30a过表 达稳走细胞系。
[0266] 6.2裸鼠皮下成瘤实验具体步骤：
[0267] 1)HCT116细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，无血清的培养基洗3遍后，细胞计数后 调整为2.5X107个/mL;
[0268] 2)用lmL注射器吸取细胞液以皮下注射接种，每只裸鼠用200yL细胞液，即5 X106 个细胞/只，每组8只；
[0269] 3)隔两天用游标卡尺测量肿瘤体积，计算体积公式:V= 1/2 X L X W2(V，Volume;L， Length；ff,Width)；
[0270] 4)处死裸鼠分离肿瘤组织后，称重。
【主权项】
1. 一种与癌细胞或肿瘤辅助诊断相关的标志物，其特征在于该标志物为miR-30a和HP1 γ中的任意一种或两种，所述的HP1 γ为HP1 γ基因或/和HP1 γ蛋白；优选的该标志物为 miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白的组合。 2. miR-30a和ΗΡ1 γ中的任意一种或两种作为癌细胞或肿瘤辅助诊断标志物中的应用。3. 权利要求1所述的标志物在制备癌细胞或肿瘤辅助诊断试剂盒中的应用。4. 一种用于检测miR-30a表达水平的试剂盒或生物芯片，其特征在于该试剂盒或生物 芯片中包括用于检测血液或肿瘤组织中的miR_30a表达水平的特异性引物。5. -种用于检测ΗΡΙγ蛋白表达水平的试剂盒，其特征在于该试剂盒中包括用于检测 血液或肿瘤组织中的ΗΡ1 γ蛋白表达水平的特异性抗体。6. -种癌细胞或肿瘤辅助诊断试剂盒或生物芯片，其特征在于该试剂盒或生物芯片用 于检测血液或肿瘤组织中的miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白mRNA的双表达水平。7. 根据权利要求6所述的癌细胞或肿瘤辅助诊断试剂盒或生物芯片，其特征在于该试 剂盒或生物芯片含有用于检测miR_30a表达水平和HP1 γ蛋白mRNA的特异性引物和用于检 测HP1 γ蛋白表达水平的特异性抗体;优选的，该试剂盒中还包括PCR技术常用的试剂和免 疫组化技术常用的试剂。8. -种在癌细胞或肿瘤中高表达的ΗΡ1 γ蛋白的活性、作用、及表达量的抑制物，其特 征在于该抑制物为ΗΡΙγ基因及其蛋白产物的抑制物，优选的该抑制物为包括抗体、化学抑 制物和miRNA抑制物以及类似物中的至少一种;优选的，所述的miRNA抑制物为miR-30a以及 类似物，进一步优选为miR-30a。 9 .miR-30a在制备抑制癌细胞或肿瘤药物中的应用。10.权利要求1~3、6~9任意一项中所述的癌细胞包括结直肠癌细胞及其他类似的上 皮癌细胞;所述的肿瘤包括肠癌及其他上皮肿瘤;优选的，所述的上皮肿瘤包括肺癌、肝癌、 胃癌、卵巢癌、宫颈癌。
【文档编号】G01N33/574GK106093400SQ201610463963
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】赵 权, 刘明, 陈玉根, 鞠君毅, 王亚东, 王莹, 聂敏, 黄菲菲, 李祝臣
【申请人】成都山权江生物科技有限公司