一种动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法
【专利摘要】本发明提供了一种动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，包括，对动植物油中甘三酯进行层析分离并收集甘油三酯，将其用脂肪酶水解后，对水解产物经薄层层析分离，确定α游离脂肪酸并收集进行衍生化处理，进气相色谱检测，测定甘油三酯中α位脂肪酸的组成及含量。该方法具有操作简便、试剂安全、需要溶剂消耗量少、分析结果准确、检测限低、分析时间快的优点、样品需求量低。
【专利说明】
一种动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法
技术领域
[0001]本发明属于油脂测定领域，具体涉及一种动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法。
【背景技术】
[0002]食用动植物油的主要组成成分为甘油三酯，其含量占总脂类的95%以上，5%为其他脂类，如甘油二酯，单甘油酯，脂肪酸、磷脂、糖脂和固醇类等。甘油三酯是由一分子甘油和三分子脂肪酸通过酯化反应生成，酯化的脂肪酸分别位于α和m立，其化学结构式如附图2。
[0003]天然存在的油脂由于来源、脂肪酸种类和含量，碳链长短、双键数目、双键位置的差异而具有不同的理化性质和流变特性。不仅如此，脂肪酸在甘三酯中的位置分布决定着甘三酯的消化，吸收，代谢及营养价值。例如:棕榈酸(C16:0)是母乳中的主要脂肪酸组分(占总脂肪酸25%)，其中彡65%位于M立置上，被胰脂酶水解形成甘一酯，与胆盐形成乳糜微粒而被机体吸收。而牛乳和婴儿配方乳中的棕榈酸主要分布在α位，其被胰脂酶水解为游离脂肪酸，易与Ca 2+形成钙皂，不能被人体很好地吸收利用。而甘三酯中的油酸(C18:1)位于α位时更容易被机体利用，提供能量。另外，硬脂酸(C18:0)处于α位时不具有升高血脂和胆固醇的作用，而位于β位时则与肉豆蔻酸(C 14:0)和棕榈酸(C 16:0) —样具有升高血液胆固醇作用。同时，酰化位置对血浆脂肪酸分布也有重要影响，因此油脂中脂肪酸组成固然重要，但脂肪酸的位置分布也不容忽视，这就需要对油脂中脂肪酸的位置分布进行测定。
[0004]目前，国内外开展了大量的关于甘三酯α或M立脂肪酸检测技术的研究工作。常用的测定甘三酯中脂肪酸位置分布的方法有胰脂酶水解法和格氏降解法。胰脂酶水解法是根据胰脂酶的α特异性，通过水解甘三酯α位上的脂肪酸，对甘一酯进行测定，分析脂肪酸的位置分布的一种常用的酶解方法。然而，胰脂酶水解具有脂肪酸和立体区位选择性，尤其是对多不饱和脂肪酸和中短链脂肪酸，所以，无法准确分析这些脂肪酸的位置分布。另一种方法是格氏降解法，格氏反应将甘三酯α位酯化脂肪酸降解，对生成的甘二酯进行测定，从而计算出脂肪酸位置分布的一种化学方法。此方法可以避免胰脂酶对脂肪酸的选择性水解，但是，烯丙基溴化镁遇水极易失活，且具有毒性。因此，探索其他脂肪酶特异性水解动植物油脂检测甘三酯α位脂肪酸组成的方法，对深入分析动植物甘三酯的结构有重要意义。
【发明内容】
[0005]本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0006]鉴于上述和/或现有动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法中存在的问题，提出了本发明。
[0007]因此，本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案:一种动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，其特征在于，包括，对动植物油中甘三酯进行层析分离并收集甘油三酯，将其用脂肪酶水解后，对水解产物经薄层层析分离，确定α游离脂肪酸并收集进行衍生化处理，进气相色谱检测，测定甘油三酯中α位脂肪酸的组成及含量。
[0009]作为本发明所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法的一种优选方案，其中:所述层析分离，其是采用硅胶柱层析分离，其中，柱层析洗脱液为石油醚和乙醚，其体积比为80?90:10?15，洗脱速度为I?3ml/min。
[0010]作为本发明所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法的一种优选方案，其中:所述脂肪酶水解，其是加入脂肪酶、胆酸钠、CaCl2:，在37?55°C下，保持15?25min，然后在3000?5000r/min的条件下，离心5min。
[0011]作为本发明所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法的一种优选方案，其中:所述脂肪酶为米根霉发酵生产的α特异性脂肪酶，其添加量为甘油三酯质量的5?15%。
[0012]作为本发明所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法的一种优选方案，其中:所述脂肪酶水解，还加入MgCl2，且满足添加后Mg2+在混合液中的浓度为3?4mmol/L。
[0013]作为本发明所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法的一种优选方案，其中:所述薄层层析分离，其是将硅胶G板置于105°C烘箱中活化lh，然后用0.4mol/L硼酸溶液饱和处理，自然通风晾干后进行展开，在薄板上均匀喷洒0.2?丨％的2，7二氯荧光素的甲醇溶液并在紫外灯下显色处理，油酸作为参照标样，确定α-游离脂肪酸在高效薄层色谱上的位置，将α-游离脂肪酸条带刮下，用乙醚提取。
[0014]作为本发明所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法的一种优选方案，其中:所述进行展开，其中，使用的扩展液为己烷、乙醚、乙酸按体积比为70?80:20?30:0.5?I的混合液，处理时间为40?50min。
[0015]作为本发明所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法的一种优选方案，其中:所述衍生化处理，其是使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入I?2mL正己烷和0.5?ImL I?1.5mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液，将混合液祸旋混勾lmin，4000?5000r/min离心3?5min，收集上清液。
[0016]作为本发明所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法的一种优选方案，其中:所述进气相色谱检测，其是吸取上清液于进样瓶中，采用气相色谱-氢火焰离子检测，载气为纯度大于99.99 %的氮气，载气流速为1.0mL/min，分流比为100?50: I，气化室温度250?3000C，FID检测器温度为250?300°C，进样体积1.0yL，气相色谱柱规格为SP-2560、10mX
0.25mm、0.20ym 毛细管柱。
[0017]作为本发明所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法的一种优选方案，其中:所述气相色谱-氢火焰离子检测分析条件为程序升温，其初始温度为80?100°C，保持2?5min，以5?15°C/min升至 160?200°C，保持2?5min，再以5?15°C/min升温至210?230°C。
[0018]本发明所具有的有益效果:
[0019]本发明将层析分离、脂肪酶水解、薄层层析、脂肪酸衍生化、气相色谱检测五个环节优选结合以及参数条件优选优化(包括酶解条件、展开剂相关因素等)，形成独有的对动植物油脂甘三酯α位脂肪酸进行测定的方法，该方法具有操作简便、试剂安全、需要溶剂消耗量少、分析结果准确、检测限低、分析时间快的优点、样品需求量低。
【附图说明】
[0020]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中:
[0021 ] 图1是实施例1?5中甲酯化衍生物在SP-2560 ,10mX0.25mm，0.20μπι毛细管气相色谱柱上的分离图谱，根据出峰顺序确定各种脂肪酸甲酯的保留时间。
[0022]图2是甘油三酯的化学结构式。
【具体实施方式】
[0023]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。
[0024]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0025]其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0026]薄层层析是一种物理的分离方法，利用混合物中各组份物理化学性质的差别，不同程度地分布在两个不相混溶的相中。其中一个为固定相，另一个为流过固定相的流动相，各组份以不同速度移动，从而达到分离。吸附层析的原理主要依靠样品中各组份对吸附剂不同的亲和力以及对溶剂(展开剂)不同的溶解度而得到的分离。在展开时溶剂由于毛细管的作用向上移动，那些对吸附剂亲和力强、在溶剂中溶解度小的组份，向上移动较慢。而某些对吸附剂亲和力弱在溶剂中溶解度大的组分，就较快地向上移动。这样，由于物质移动速度的不同，样品中各种组份，就能得到分离。固定相的选择、层析中的进样量、洗脱剂的极性、洗脱剂的流速等都会对最终结果造成影响。展开剂的选择是薄层层析的一个重要关键，主要根据样品和溶剂的极性或样品在溶剂中的溶解度来决定。基于此，本发明经过进一步优选优化，使用的扩展液为己烧、乙醚、乙酸按体积比为70?80: 20?30: 0.5?I的混合液，处理时间为40?50min，此时可实现α游离脂肪酸高度纯化分离。
[0027]实施例1
[0028]步骤I大豆油中甘油三酯的分离提取
[0029]采用硅胶柱层析的方法分离获取甘油三酯。柱层析洗脱液为石油醚:乙醚(80?90:10?15，V/V)。称取油脂样品约I?5g，转移至10?50ml容量瓶中，用洗脱液定容。取层析柱(尺寸规格I?3cmX 30?50cm)，在底部放少许玻璃棉或海砂，将洗脱液和硅胶搅拌均匀混合，加入装柱。吸取油样20?30ml，沿层析柱壁缓缓加入，然后用100?500ml洗脱液进行洗脱，速度约为I?3ml/min，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂。
[0030]步骤2脂肪酶Lipase DF水解甘三酯
[0031]称取分离所得甘油三酯0.2g于1mL具塞试管中，加入LipaseDF脂肪酶10mg，再加入0.2mol/L Tris-HCl缓冲液2mL，小心摇动，然后加入0.5mL胆酸钠溶液、0.2mL CaCl2溶液和2.5mg MgCl2盖上塞子小心摇动，立即将试管放入37°C恒温水浴锅中，保持反应15min，取出，用振荡器剧烈震动2min，立即加入ImL盐酸和ImL乙醚，盖上塞子，并用振荡器剧烈震摇，5000r/min离心5min分离，吸取乙醚层，用0.45μηι滤膜过滤到样品瓶中。
[0032]步骤3高效薄层层析色谱法分离纯化α游离脂肪酸
[0033]利用高效薄层色谱(TLC)分离水解产物中的β-甘一酯和α-游离脂肪酸。薄层层析分离条件为:硅胶G板置于105°C烘箱中活化lh，然后用0.4mol/L硼酸溶液饱和处理，自然通风晾干后使用。所用的扩展液为:正己烷-乙醚-乙酸(75:25:0.5，V/V/V)，大约45min后展开完毕，在薄板上均匀喷洒0.2wt %的2，7-二氯荧光素的甲醇溶液并在紫外灯下显色处理。油酸作为参照标样，确定α-游离脂肪酸在TLC上的位置，将α-游离脂肪酸条带刮下，用乙醚提取三次，合并待用。
[0034]步骤4α_游离脂肪酸甲酯化
[0035]使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入ImL 0.5mo I/L的NaOH-CH3OH溶液，置于65°C振荡皂化30min至无油滴，然后升温至70°C，加入2mL BF3-CH3OH溶液(体积比1:3，现配现用)，加热3min，冷却至室温后加入2mL正己烧，将混合液祸旋混勾Imin，4000?5000r/min离心3?5min，收集上清液。
[0036]步骤5GC法测定α游离脂肪酸组成
[0037]吸取上清液于气相色谱进样瓶中，采用气相色谱分析α位脂肪酸组成，分析条件为:岛津GC-2014气相色谱仪，色谱柱SP-2560,10mX0.25mm,0.20μπι毛细管柱，采用程序升温，初始温度80°C，保持4min，以15°C/min升至215°C，保持20min;载气为高纯氮气(彡99.99%)；载气流速为1.0mL/min ；分流比100?50: I ；气化室温度260 °C ;FID检测器温度为300°C;进样体积1.0yL。通过脂肪酸甲酯混标的保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol % ο
[0038]实施例2
[0039]步骤I亚麻籽油中甘油三酯的分离提取
[0040]采用硅胶柱层析的方法分离获取甘油三酯。柱层析洗脱液为石油醚:乙醚(80?90:10?15，V/V)。称取油脂样品约I?5g，转移至10?50ml容量瓶中，用洗脱液定容。取层析柱(尺寸规格I?3cmX 30?50cm)，在底部放少许玻璃棉或海砂，将洗脱液和硅胶搅拌均匀混合，加入装柱。吸取油样20?30ml，沿层析柱壁缓缓加入，然后用100?500ml洗脱液进行洗脱，速度约为I?3ml/min，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂。
[0041 ] 步骤2脂肪酶Lipase DF水解甘三酯
[0042]称取分离所得甘油三酯0.2g于1mL具塞试管中，加入LipaseDF脂肪酶20mg，再加入0.2mol/L Tris-HCl缓冲液2mL，小心摇动，然后加入0.5mL胆酸钠溶液、0.2mL CaCl2溶液和1.5mg MgCl2盖上塞子小心摇动，立即将试管放入40°C恒温水浴锅中，保持反应15min，取出，用振荡器剧烈震动2min，立即加入ImL盐酸和ImL乙醚，盖上塞子，并用振荡器剧烈震摇，4000r/min离心5min分离，吸取乙醚层，用0.45μηι滤膜过滤到样品瓶中；
[0043]步骤3高效薄层层析色谱法分离纯化α游离脂肪酸
[0044]利用高效薄层色谱(TLC)分离水解产物中的β-甘一酯和α-游离脂肪酸。薄层层析分离条件为:硅胶G板置于105°C烘箱中活化lh，然后用0.4mol/L硼酸溶液饱和处理，自然通风晾干后使用。所用的扩展液为:正己烷-乙醚-乙酸(80:20:1，V/V/V)，大约50min后展开完毕，在薄板上均匀喷洒0.2wt %的2，7-二氯荧光素的甲醇溶液并在紫外灯下显色处理。油酸作为参照标样，确定α-游离脂肪酸在TLC上的位置，将α-游离脂肪酸条带刮下，用乙醚提取三次，合并待用。
[0045]步骤4α_游离脂肪酸甲酯化
[0046]使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入ImL 0.5mol/L的NaOH-CH3OH溶液，置于65°C振荡皂化30min至无油滴，然后升温至70°C，加入2mL BF3-CH3OH溶液(体积比1:3，现配现用)，加热3min，冷却至室温后加入2mL正己烧，将混合液祸旋混勾Imin，4000?5000r/min离心3?5min，收集上清液。
[0047]步骤5GC法测定α游离脂肪酸组成
[0048]吸取上清液于气相色谱进样瓶中，采用气相色谱分析α位脂肪酸组成，分析条件为:岛津GC-2014气相色谱仪，色谱柱SP-2560,10mX0.25mm,0.20μπι毛细管柱，采用程序升温，初始温度100°C，保持3min，以10°C/min升至220°C，保持30min;载气为高纯氮气(彡99.99%)；载气流速为1.0mL/min ；分流比100?50: I ；气化室温度260 °C ;FID检测器温度为300°C;进样体积1.0yL。通过脂肪酸甲酯混标的保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol % ο
[0049]实施例3
[0050]步骤I奶油中甘油三酯的分离提取
[0051]采用硅胶柱层析的方法分离获取甘油三酯。柱层析洗脱液为石油醚:乙醚(80?90:10?15，V/V)。称取油脂样品约I?5g，转移至10?50ml容量瓶中，用洗脱液定容。取层析柱(尺寸规格I?3cmX 30?50cm)，在底部放少许玻璃棉或海砂，将洗脱液和硅胶搅拌均匀混合，加入装柱。吸取油样20?30ml，沿层析柱壁缓缓加入，然后用100?500ml洗脱液进行洗脱，速度约为I?3ml/min，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂。
[0052]步骤2脂肪酶Lipase DF水解甘三酯
[0053]称取分离所得甘油三酯0.1g于1mL具塞试管中，加入Lipase DF脂肪酶10mg，再加入0.2mol/L Tris-HCl缓冲液2mL，小心摇动，然后加入0.5mL胆酸钠溶液、0.2mL CaCl2溶液和2.0mg MgCl2盖上塞子小心摇动，立即将试管放入40°C恒温水浴锅中，保持反应15min，取出，用振荡器剧烈震动2min，立即加入ImL盐酸和ImL乙醚，盖上塞子，并用振荡器剧烈震摇，3000r/min离心5min分离，吸取乙醚层，用0.45μηι滤膜过滤到样品瓶中；
[0054]步骤3高效薄层层析色谱法分离纯化α游离脂肪酸
[0055]利用高效薄层色谱(TLC)分离水解产物中的β-甘一酯和α-游离脂肪酸。薄层层析分离条件为:硅胶G板置于105°C烘箱中活化lh，然后用0.4mol/L硼酸溶液饱和处理，自然通风晾干后使用。所用的扩展液为:正己烷-乙醚-乙酸(70:30:1，V/V/V)，大约40min后展开完毕，在薄板上均匀喷洒0.2wt %的2，7-二氯荧光素的甲醇溶液并在紫外灯下显色处理。油酸作为参照标样，确定α-游离脂肪酸在TLC上的位置，将α-游离脂肪酸条带刮下，用乙醚提取三次，合并待用。
[0056]步骤4α_游离脂肪酸甲酯化
[0057]使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入ImL 0.5mo I/L的NaOH-CH3OH溶液，置于65°C振荡皂化30min至无油滴，然后升温至70°C，加入2mL BF3-CH3OH溶液(体积比1:3，现配现用)，加热3min，冷却至室温后加入2mL正己烧，将混合液祸旋混勾Imin，4000?5000r/min离心3?5min，收集上清液。
[0058]步骤5GC法测定α游离脂肪酸组成
[0059]吸取上清液于气相色谱进样瓶中，采用气相色谱分析α位脂肪酸组成，分析条件为:岛津GC-2014气相色谱仪，色谱柱SP-2560,10mX0.25mm,0.20μπι毛细管柱，采用程序升温，初始温度80°C，保持4min，以15°C/min升至220°C，保持20min;载气为高纯氮气(彡99.99%)；载气流速为1.0mL/min ；分流比100?50: I ；气化室温度260 °C ;FID检测器温度为300°C;进样体积1.0yL。通过脂肪酸甲酯混标的保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol % ο
[0060]实施例4
[0061 ]步骤I棕榈油中甘油三酯的分离提取
[0062]采用硅胶柱层析的方法分离获取甘油三酯。柱层析洗脱液为石油醚:乙醚(80?90:10?15，V/V)。称取油脂样品约I?5g，转移至10?50ml容量瓶中，用洗脱液定容。取层析柱(尺寸规格I?3cmX 30?50cm)，在底部放少许玻璃棉或海砂，将洗脱液和硅胶搅拌均匀混合，加入装柱。吸取油样20?30ml，沿层析柱壁缓缓加入，然后用100?500ml洗脱液进行洗脱，速度约为I?3ml/min，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂。
[0063]步骤2脂肪酶Lipase DF水解甘三酯
[0064]称取分离所得甘油三酯0.2g于1mL具塞试管中，加入LipaseDF脂肪酶10mg，再加入0.2mol/L Tris-HCl缓冲液2mL，小心摇动，然后加入0.5mL胆酸钠溶液、0.2mL CaCl2溶液和2.5mg MgCl2盖上塞子小心摇动，立即将试管放入45°C恒温水浴锅中，保持反应15min，取出，用振荡器剧烈震动2min，立即加入ImL盐酸和ImL乙醚，盖上塞子，并用振荡器剧烈震摇，4000r/min离心5min分离，吸取乙醚层，用0.45μηι滤膜过滤到样品瓶中。
[0065]步骤3高效薄层层析色谱法分离纯化α游离脂肪酸
[0066]利用高效薄层色谱(TLC)分离水解产物中的β-甘一酯和α-游离脂肪酸。薄层层析分离条件为:硅胶G板置于105°C烘箱中活化lh，然后用0.4mol/L硼酸溶液饱和处理，自然通风晾干后使用。所用的扩展液为:正己烷-乙醚-乙酸(80:20:0.5，V/V/V)，大约40min后展开完毕，在薄板上均匀喷洒0.2wt %的2，7-二氯荧光素的甲醇溶液并在紫外灯下显色处理。油酸作为参照标样，确定α-游离脂肪酸在TLC上的位置，将α-游离脂肪酸条带刮下，用乙醚提取三次，合并待用。
[0067]步骤4α_游离脂肪酸甲酯化
[0068]使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入ImL 0.5mol/L的NaOH-CH3OH溶液，置于65°C振荡皂化30min至无油滴，然后升温至70°C，加入2mL BF3-CH3OH溶液(体积比1:3，现配现用)，加热3min，冷却至室温后加入2mL正己烧，将混合液祸旋混勾Imin，4000?5000r/min离心3?5min，收集上清液。
[0069]步骤5GC法测定α游离脂肪酸组成
[0070]吸取上清液于气相色谱进样瓶中，采用气相色谱分析α位脂肪酸组成，分析条件为:岛津GC-2014气相色谱仪，色谱柱SP-2560,10mX0.25mm,0.20μπι毛细管柱，采用程序升温，初始温度100°C，保持3min，以15°C/min升至220°C，保持30min;载气为高纯氮气(彡99.99%)；载气流速为1.0mL/min ；分流比10?50: I ；气化室温度260 °C ;FID检测器温度为300°C;进样体积1.0yL。通过脂肪酸甲酯混标的保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol % ο
[0071]实施例5
[0072]步骤I鸡脂的提取
[0073]通过真空干燥脱去鸡脂中水分，加入氯仿/甲醇(2:1，V01/V01)的混合物，并充分均质震荡。然后再加入1/4体积的NaCl水溶液(0.86% ,w/w)，充分震荡平衡。收集有机相，过滤，并采用旋转蒸发脱除有机溶剂，所得脂质储存在-18 °C下。
[0074]步骤2鸡脂中甘油三酯的分离提取
[0075]采用硅胶柱层析的方法分离获取甘油三酯。柱层析洗脱液为石油醚:乙醚(80?90:10?15，V/V)。称取油脂样品约I?5g，转移至10?50ml容量瓶中，用洗脱液定容。取层析柱(尺寸规格I?3cmX 30?50cm)，在底部放少许玻璃棉或海砂，将洗脱液和硅胶搅拌均匀混合，加入装柱。吸取油样20?30ml，沿层析柱壁缓缓加入，然后用100?500ml洗脱液进行洗脱，速度约为I?3ml/min，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯，氮吹除去有机溶剂。
[0076]步骤3脂肪酶Lipase DF水解甘三酯
[0077]称取分离所得甘油三酯0.2g于1mL具塞试管中，加入LipaseDF脂肪酶30mg，再加入0.2mol/L Tris-HCl缓冲液2mL，小心摇动，然后加入0.5mL胆酸钠溶液、0.2mL CaCl2溶液和1.5mg MgCl2盖上塞子小心摇动，立即将试管放入55°C恒温水浴锅中，保持反应25min，取出，用振荡器剧烈震动2min，立即加入ImL盐酸和ImL乙醚，盖上塞子，并用振荡器剧烈震摇，5000r/min离心5min分离，吸取乙醚层，用0.45μηι滤膜过滤到样品瓶中。
[0078]步骤4高效薄层层析色谱法分离纯化α游离脂肪酸
[0079]利用高效薄层色谱(TLC)分离水解产物中的β_甘一酯和α-游离脂肪酸。薄层层析分离条件为:硅胶G板置于105°C烘箱中活化lh，然后用0.4mol/L硼酸溶液饱和处理，自然通风晾干后使用。所用的扩展液为:正己烷-乙醚-乙酸(80:20:1，V/V/V)，大约50min后展开完毕，在薄板上均匀喷洒0.2wt %的2，7-二氯荧光素的甲醇溶液并在紫外灯下显色处理。油酸作为参照标样，确定α-游离脂肪酸在TLC上的位置，将α-游离脂肪酸条带刮下，用乙醚提取三次，合并待用。
[0080]步骤5α_游离脂肪酸甲酯化
[0081 ] 使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入ImL 0.5mo I/L的NaOH-CH3OH溶液，置于65°C振荡皂化30min至无油滴，然后升温至90°C，加入2mL BF3-CH3OH溶液(体积比1:3，现配现用)，加热3min，冷却至室温后加入2mL正己烧，将混合液祸旋混勾Imin，4000?5000r/min离心3?5min，收集上清液。
[0082]步骤6GC法测定α游离脂肪酸组成
[0083]吸取上清液于气相色谱进样瓶中，采用气相色谱分析α位脂肪酸组成，分析条件为:岛津GC-2014气相色谱仪，色谱柱SP-2560,10mX0.25mm,0.20μπι毛细管柱，采用程序升温，初始温度100°C，保持4min，以10°C/min升至225°C，保持30min;载气为高纯氮气(彡99.99%)；载气流速为1.0mL/min ；分流比100?50: I ；气化室温度260 °C ;FID检测器温度为300°C;进样体积1.0yL。通过脂肪酸甲酯混标的保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol % ο
[0084]酶解温度的控制非常重要，由于酶促催化反应是一个热动力学过程，影响着酶的催化活性、底物的溶解状态及粘度、底物和产物的传质速度等。温度太低，不利于达到反应所需的活化能，脂肪酶不能与底物有效结合，反应速率较低，反应时间延长，产物中甘三酯水解程度低;温度太高，则会导致脂肪酶变性，降低酶活。
[0085]加酶量的大小和酶解速度直接相关，如果底物的量能够保持足够大，且反应速度与酶量也符合动力学关系，当酶量增加时，酶解速度亦随之增大。脂肪酶添加量太少，则降低反应速率。脂肪酶添加量过多，也就是底物含量相对较低时，虽然这时酶解速度也随着增大，但底物和产物的传质阻力的影响已开始大于酶酶解催化速度的影响，其酶解速度的增量减少，酶的催化效率降低。
[0086]发明人研究发现，随着反应的进行，一定速率的搅拌对酶法合成反应的形成具有促进作用，但过搅拌速率过高却反而不利于酶解的进行。不同搅拌速率下，样品的硬度等存在差异可能与其微观交联度有关。同时交联结构的强度和数量也直接影响到体系的粘弹性會K。
[0087]米根霉发酵生产的α特异性脂肪酶属于α/β水解酶，α/β水解酶是指一类酶活依赖于由Ser、HiS和Asp残基形成的催化三联体的酶类。米根霉发酵生产的α特异性脂肪酶偏爱于水不溶性底物，其在水解前吸附于水/油界面，催化反应时伴随大量的构相改变。发明人研究发现，酶解溶液中Mg2+的含量为3?4mmol/L时，能够加速水/油界面上瞬间的四面体中间态的形成，以提高甘三酯的酶解速率。
[0088]应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1.一种动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，其特征在于:包括， 对动植物油中甘三酯进行层析分离并收集甘油三酯； 将其用脂肪酶水解后，对水解产物经薄层层析分离，确定α游离脂肪酸并收集进行衍生化处理； 进气相色谱检测，测定甘油三酯中α位脂肪酸的组成及含量。2.根据权利要求1所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，其特征在于:所述层析分离，其是采用硅胶柱层析分离，其中，柱层析洗脱液为石油醚和乙醚，其体积比为80?90:10?15，洗脱速度为I?3ml/min。3.根据权利要求1或2所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，其特征在于:所述脂肪酶水解，其是加入脂肪酶、胆酸钠、CaCl2，在37?55°C下，保持15?25min，然后在3000?5000r/min的条件下，离心5min。4.根据权利要求1或2所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，其特征在于:所述脂肪酶为米根霉发酵生产的α特异性脂肪酶，其添加量为甘油三酯质量的5?15%。5.根据权利要求3所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，其特征在于:所述脂肪酶水解，还加入MgCl2，且满足添加后Mg2+在混合液中的浓度为3?4mmol/L。6.根据权利要求1、2或5任一所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，其特征在于:所述薄层层析分离，其是将硅胶G板置于105°C烘箱中活化lh，然后用0.4mol/L硼酸溶液饱和处理，自然通风晾干后进行展开，在薄板上均匀喷洒0.2wt %的2，7-二氯荧光素的甲醇溶液并在紫外灯下显色处理，油酸作为参照标样，确定α-游离脂肪酸在高效薄层色谱上的位置，将α-游离脂肪酸条带刮下，用乙醚提取。7.根据权利要求6所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，其特征在于:所述进行展开，其中，使用的扩展液为己烷、乙醚、乙酸按体积比为70?80: 20?30: 0.5?I的混合液，处理时间为40?50min。8.根据权利要求1、2、5或7任一所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，其特征在于:所述衍生化处理，其是使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入I?2mL正己烷和0.5?ImL I?1.5mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液，将混合液祸旋混勾lmin，4000?5000r/min离心3?5min，收集上清液。9.根据权利要求1、2、5或7任一所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，其特征在于:所述进气相色谱检测，其是吸取上清液于进样瓶中，采用气相色谱-氢火焰离子检测，载气为纯度大于99.99%的氮气，载气流速为1.0mL/min，分流比为100?50: I，气化室温度250?300°C，FID检测器温度为250?300°C，进样体积l.0yL，气相色谱柱规格为SP-2560、10mX0.25mm、0.20ym 毛细管柱。10.根据权利要求9所述动植物油脂甘三酯α位脂肪酸的测定方法，其特征在于:所述气相色谱-氢火焰离子检测分析条件为程序升温，其初始温度为80?10tC，保持2?5min，以5?15°C/min升至160?200°C，保持2?5min，再以5?15°C/min升温至210?230°C。
【文档编号】G01N30/90GK106093270SQ201610756780
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月27日
【发明人】王兴国, 张惠君, 金青哲, 刘睿杰, 常明, 黄健花
【申请人】江南大学