一种测定脂蛋白磷脂酶a2的试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，试剂R1：缓冲液、无机盐离子、加速剂、螯合剂、防腐剂，试剂R2：缓冲液、稳定剂、防腐剂、乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的脂蛋白磷脂酶A2的浓度。本发明具有测定准确度高等优点。
【专利说明】
一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试 剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 脂蛋白磷脂酶A2(Lp_PLA2)是磷脂酶超家族中的亚型之一，也被称为是血小板活 化因子乙酰水解酶，由血管内膜中的巨噬细胞、T细胞和肥大细胞分泌，动脉粥样硬化斑块 中Lp-PLA2表达上调，并且在易损斑块纤维帽的巨噬细胞中强表达，Lp-PLA2可水解氧化低 密度脂蛋白ox-LDL中的氧化磷脂，生成脂类促炎物质，如溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸，进 而产生多种致动脉粥样硬化作用，包括内皮细胞死亡和内皮功能异常，刺激粘附因子和细 胞因子的产生，这些物质可通过趋化炎症细胞进一步产生自我强化的循环，生成更多促炎 物质。 释放到血液循环中的脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)主要与富含载脂蛋白（Apo)B的脂蛋白 结合，低密度脂蛋白（LDL)占80%，其余与高密度脂蛋白（HDL)、脂蛋白a[Lp(a)]和极低密度 脂蛋白（VLDL)结合，在动脉粥样硬化性疾病患者中，脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)水平与LDL 亚组分水平呈正相关。
[0003] 目前，检测脂蛋白磷脂酶A2(Lp_PLA2)主要采取酶联免疫吸附法，但其操作复杂， 耗时长，且对操作人员有较高专业技术要求，且该检测法无法定量，受外界影响的因素较 多，而且测定准确度低，需要作出进一步的改进。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、测定准确度低的缺 陷，而提供一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒及其制备方法。
[0005] 本发明解决上述技术问题提供的技术方案是:本发明公开了一种测定脂蛋白磷脂 酶A2的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: 缓冲液 20~180 mmol/L 无机盐离子 20CK400 mmol/L 加速剂 5~25 g/L 整合剂 15~45 mmol/L 防腐剂 0.2~0.8 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 50~150 mmol/L 稳定剂 4~18 g/L 防腐剂 0.6~0.9 g/L 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体 1~9 g/L 其溶剂为纯化水。
[0006] 作为优选，本发明公开了一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒，包括彼此独立的试 剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: 缓冲液 100mmol/L 无机盐离子 300 mmol/L 加速剂 10 g/L 整合剂 25 mmol/L 防腐剂 0.6 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 100 mmol/L 稳定剂 11 g/L 防腐剂 0.7 g/L 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体 5 g/L 其溶剂为纯化水。
[0007] 作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓 冲液、M0PS0缓冲液中的一种或多种的组合，所述的无机盐离子采用氯化钾、硫酸钾、氯化钠 中的一种或多种的组合，所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷 酮中的一种或多种的组合，所述的螯合剂采用EDTA ? 2Na、二乙基三胺五乙酸、乙二醇双四 乙酸中的一种或多种的组合，所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚 中的一种或多种的组合。
[0008] 作为优选，所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓 冲液、M0PS0缓冲液中的一种或多种的组合，所述的稳定剂为牛血清白蛋白，所述的防腐剂 采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合。
[0009] 作为优选，所述的试剂R2中，所述的乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的制备方法 为:先用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙 烯微球的质量浓度为1%_5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基 胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在20°C_37°C的条件下反应1小时，然后使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，然后使 用超声分散仪进行超声分散，然后使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去 上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-4%，使用超声分散仪进行分散，然后边分散边加入抗脂蛋白磷脂酶A2抗体，直至聚苯乙烯微 球的质量浓度为〇 . 5%-2.0%时为止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的浓度为 20g/L时为止，4°C封闭16-24小时，即可制备得到乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体。
[0010] 作为优选，本发明还公开了上述测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒的制备方法和使用 方法，包括以下步骤： (a)按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: 缓冲液 20~180 mmol/L 无机盐离子 200~400 mmol/L 加速剂 5~25 g/L 整合剂 15~45 mmol/L 防腐剂 0.2~0.8 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 50~150 mmol/L 稳定剂 4~18 g/L 防腐剂 0.6~0.9 g/L 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体 1~9 g/L 其溶剂为纯化水； (b) 将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应； (c) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (d) 根据吸光度变化值计算出样本中的脂蛋白磷脂酶A2的浓度。
[0011]作为优选，步骤(b)中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为4:1; 作为优选，步骤(b)中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:10到 1:150之间。
[0012]本发明的检测原理是:本发明利用的是抗原抗体反应的原理，脂蛋白磷脂酶A2与 超敏化的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体胶乳颗粒试剂反应，出现凝集反应，在特定的波长下检测 其吸光度，其变化程度与样本中的Lp-PLA2含量成正比。
式中：A At以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值 A As以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值 Cs校准液中Lp-PLA2的浓度。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明在试剂R1中添加了金属离子 螯合剂，在样本和试剂R1反应的过程中，去除了样本中金属离子的干扰，因此测定准确度得 到大大的提高，且在加速剂聚乙二醇作用下，可快速发生反应，检测比较方便，灵敏度比较 高，而且无放射性污染。
【具体实施方式】
[0015] 以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
[0016] 实施例1 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中 试剂R1: MES 缓冲液 100mmol/L 氯化钾 300 mmol/L 聚乙二醇-2000 10 g/L EDTA ? 2Na 25 mmol/L 山梨酸钠 0.6 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: MES缓冲液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 11 g/L 叠氮钠 0.7 g/L 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体 5 g/L 其溶剂为纯化水。
[0017] 实施例2 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中 试剂R1: Tris缓冲液 20 mmol/L 硫酸钾 200 mmol/L 聚乙烯吡咯烷酮 25 g/L 二乙基三胺五乙酸 45 mmol/L 山梨酸钠 0.2 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 150 mmol/L 牛血清白蛋白 18 g/L 山梨酸钠 0. 9 g/L 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体 1 g/L 其溶剂为纯化水。 实施例3 试剂盒的制备和使用方法 1、 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的制备：先用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为 120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为5%的溶液，然后每毫升 溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在26°C的条件下反 应1小时，然后使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，然后使用超声分散仪进行超声分散，然后使用离心机，在 25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀 释，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为4%，使用超声分散仪进行分散，然后边分散边加入抗脂 蛋白磷脂酶A2抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1.0%时为止，最后加入牛血清白蛋白， 直至牛血清白蛋白的浓度为20g/L时为止，4°C封闭18小时，即可制备得到乳胶包被抗脂蛋 白磷脂酶A2抗体； 2、 按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: MES 缓冲液 lOOmmol/L 氯化钾 300 mmol/L 聚乙二醇-2000 10 g/L EDTA ? 2Na 25 mmol/L 山梨酸钠 0.6 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: MES缓冲液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 11 g/L 叠氮钠 0.7 g/L 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体 5 g/L 其溶剂为纯化水； 3、 全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测温度:37°C; (b) 检测波长:主波长600nm; (c) 反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度 Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d) 反应方向：正反应； 4、 检测步骤 (a) 取200yl试剂R1与2.5yl待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下孵育5min; (c) 加入50yl试剂R2，立即测定读取吸光度Al，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化 AA = A2-A1; (d) 根据样本中的脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的活性
算出样本中的脂蛋白磷脂酶A2的浓度。
[0018] 实施例4 试剂盒的制备和使用方法 1、 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的制备：先用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为 120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为5%的溶液，然后每毫升 溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在26°C的条件下反 应1小时，然后使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，然后使用超声分散仪进行超声分散，然后使用离心机，在 25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀 释，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为4%，使用超声分散仪进行分散，然后边分散边加入抗脂 蛋白磷脂酶A2抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1.0%时为止，最后加入牛血清白蛋白， 直至牛血清白蛋白的浓度为20g/L时为止，4°C封闭18小时，即可制备得到乳胶包被抗脂蛋 白磷脂酶A2抗体； 2、 按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: Tris缓冲液 20 mmol/L 硫酸钾 200 mmol/L 聚乙烯吡咯烷酮 25 g/L 二乙基三胺五乙酸 45 mmol/L 山梨酸钠 0.2 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 150 mmol/L 牛血清白蛋白 18 g/L 山梨酸钠 0. 9 g/L 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体 1 g/L 其溶剂为纯化水； 3、 全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测温度:37°C; (b) 检测波长:主波长600nm; (c) 反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度 Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d) 反应方向：正反应； 4、 检测步骤 (a) 取200yl试剂R1与2.5yl待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下孵育5min; (c) 加入50yl试剂R2,立即测定读取吸光度Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 A A = A2-A1； (d) 根据样本中的脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的活性
算出样本中的脂蛋白磷脂酶A2的浓度。
[0019] 表1为实施例1所制得的测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒以及实施例2所制得的测定 脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的脂蛋白磷脂酶 A2的浓度为114 ng/mL，测定结果见表1: 表1
由表1可知，本发明所制得的测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒对质控品1的测定结果偏差 较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
[0020] 表2为实施例1所制得的测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒以及实施例2所制得的测定脂蛋 白磷脂酶A2的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的脂蛋白磷脂酶A2的 浓度为373 ng/mL，测定结果见表2:
由表2可知，本发明所制得的测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒对质控品2的测定结果偏差 较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
[0021]表3为实施例3所制得的测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒对同一待测样本进行的多 次反复测定以及实施例4所制得的测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒对同一待测样本进行的多 次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下： 表3
由表3可知本发明所制得的测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒的精密度比较好，而且由表3 可知，实施例3为最优的选择。
[0022]上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒，其特征在于:包括彼此独立的试剂R1和试剂R2 双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: 缓冲液 20~180 mmol/L 无机盐离子 200~400 mmol/L 加速剂 5~25 g/L 整合剂 15~45 mmol/L 防腐剂 0.2~0.8 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 50~150 mmol/L 稳定剂 4~18 g/L 防腐剂 0.6~0.9 g/L 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体 1~9 g/L 其溶剂为纯化水。2. 根据权利要求1所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒，其特征在于:包括彼此独 立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: 缓冲液 100mmol/L 无机盐离子 300 mmol/L 加速剂 10 g/L 整合剂 25 mmol/L 防腐剂 0.6 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 100 mmol/L 稳定剂 11 g/L 防腐剂 0.7 g/L 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体 5 g/L 其溶剂为纯化水。3. 根据权利要求1或2所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒，其特征在于:所述的 试剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、M0PS0缓冲液中的一 种或多种的组合，所述的无机盐离子采用氯化钾、硫酸钾、氯化钠中的一种或多种的组合， 所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组 合，所述的螯合剂采用EDTA · 2Na、二乙基三胺五乙酸、乙二醇双四乙酸中的一种或多种的 组合，所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组 合。4. 根据权利要求1或2所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒，其特征在于:所述的 试剂R2中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、M0PS0缓冲液中的一 种或多种的组合，所述的稳定剂为牛血清白蛋白，所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、 叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合。5. 根据权利要求1或2所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒，其特征在于:所述的 试剂R2中，所述的乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的制备方法为:先用50 mmol/L的MES缓 冲液将粒径为80_500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5% 的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸 盐，在20°C_37°C的条件下反应1小时，然后使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30 分钟，去上清，将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释，然后使用超声分散仪进行超声分 散，然后使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/ L的MES缓冲液进行稀释，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-4%，使用超声分散仪进行分 散，然后边分散边加入抗脂蛋白磷脂酶A2抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为0.5%-2.0% 时为止，最后加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的浓度为20gAJ寸为止，4°C封闭16~24 小时，即可制备得到乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体。6. 根据权利要求1或2所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒的制备方法和使用方 法，其特征在于:包括以下步骤： (a) 按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: 缓冲液 20~180 mmol/L 无机盐离子 200~400 mmol/L 加速剂 5~25 g/L 整合剂 15~45 mmol/L 防腐剂 0.2~0.8 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 50~150 mmol/L 稳定剂 4~18 g/L 防腐剂 0.6~0.9 g/L 乳胶包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体 1~9 g/L 其溶剂为纯化水； (b) 将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应； (c) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (d) 根据吸光度变化值计算出样本中的脂蛋白磷脂酶A2的浓度。7. 根据权利要求6所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒的制备方法和使用方法， 其特征在于:步骤(b)中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为4:1。8. 根据权利要求6所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒的制备方法和使用方法， 其特征在于:步骤(b)中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:10到1: 150之间。
【文档编号】G01N33/573GK106053808SQ201610358103
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】蔡晓辉, 庄庆华, 吴铮, 徐运
【申请人】安徽伊普诺康生物技术股份有限公司