一种荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，公开了一种荧光淬灭法测定原花青素?金属离子络合能力的方法，该方法利用金属离子对原花青素酚羟基的淬灭作用，将金属离子溶液逐步滴加至原花青素溶液中，记录原花青素的荧光强度衰变曲线，利用Stern?Volmer荧光淬灭方程计算得到络合反应的结合常数，利用Job’s法测定络合物中金属离子与原花青素的化学计量比。本发明所述分析方法成本低廉，操作简单，检测时间短、准确性高，应用范围广。
【专利说明】
一种荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种荧光淬灭法测定原花青素-金属 离子络合能力的方法。
【背景技术】
[0002] 原花青素(proanthocyanidin，PC)也称缩合单宁，是广泛存在于植物体内具有多 种生理活性的黄烷醇类多元酚化合物。原花青素是指从植物中分离得到的，在酸性热醇处 理下能产生花色素 (anthocyanidin)的多酸类物质，包括单宁和聚合体。单体原花青素包括 黄烷-4-醇和黄烷-3,4-二醇，聚合体原花青素有低聚和高聚两种类型。原花青素聚合体是 由黄烷-3-醇的单体结构单宁（儿茶素、表儿茶素）聚合而成的高分子聚合物，其键合(或氧 化缩合)位置常发生在杂环C4和A环的C6或C8位置，其中以直连4-8键聚合的原花青素最为 常见。
[0003] 作为酚类物质的一种，原花青素具有和金属离子络合的共性。然而和其它小分子 酚类化合物相比，原花青素与金属离子的配位络合能力要高出很多，其与金属离子的配位 络合能力比小分子的苯酚及邻苯二酚要高出几个数量级。原花青素与金属离子的配位络合 能力与原花青素的分子量有一定的关系，当原花青素经过磺化处理后，由于大分子被降解， 分子量变小，与金属尚子配位时的位阻减小，同时C环被打开，使原花青素与金属尚子络合 能力提高的更多。原花青素主要是通过其组成结构单元(如儿茶素、表儿茶素)上的酚羟基 团与金属离子发生配位反应。相比与小分子的酚酸化合物，原花青素与金属离子的配位络 合反应更为复杂，由于分子间相互作用力的存在及空间构型的原因，原花青素不同组成单 元之间对金属离子的配位络合能力并不相同。目前尚未见到对原花青素与金属离子配位络 合反应的定量关系研究的报道。尚缺乏从该反应的化学计量学或反应平衡常数等纯化学角 度关于原花青素与金属离子相互反应的定量关系研究。
[0004] 了解原花青素与金属离子的配位反应的定量关系在许多研究领域具有重要的意 义。由于原花青素分子结构中具有邻苯二酚结构，使其能够与金属离子(尤其是过渡金属元 素)通过配位反应形成络合物。原花青素与金属离子的相互作用不仅影响植物的营养和毒 素作用，还影响生态环境中其它代谢过程，如腐殖质的形成。人体中许多生化反应过程均需 要金属离子的参与。有机体内的过渡金属离子是氧自由基产生的"罪魁祸首"。铁离子在有 机体内存在亚铁离子(Fe 2+)和铁离子(Fe3+)两种明显不同的氧化状态。Fe3+是一种生物活性 相对不活泼的铁离子形式。但是在一定的条件下，特别是在特定的pH下它能够被还原成生 物活性较活泼的Fe 2+形式，并可通过芬顿反应(Fenton-type react ions)被氧化回Fe3+形 式，并产生羟基自由基；或者发生Haber-Weiss循环反应产生超氧阴离子。所产生的这些自 由基能够导致机体发生脂质过氧化反应、蛋白质的改性及DNA的损伤。原花青素能够通过与 金属离子发生配位络合形成原花青素-金属离子络合物使金属离子失去活性，从而阻止了 金属离子催化的相关生化反应的发生。原花青素与金属离子的配位络合反应特性还是制备 金属离子富集和脱除材料的基础，利用原花青素吸附金属离子的特性，可以将原花青素作 为金属离子的富集和脱除材料。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是针对目前对原花青素络合金属离子定量分析检测方法的空白，提供 一种操作简单、耗时短、准确度高、选择性强的原花青素络合金属离子定量分析检测方法。
[0006] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案:一种荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，在pH 4-9的醋酸盐缓冲液中加入原花青素溶液，用金属离子溶 液进行荧光淬灭滴定实验，根据反应溶液荧光强度的衰变曲线，利用Stern-Volmer荧光淬 灭方程计算得到原花青素与金属离子络合反应的结合常数;利用等摩尔连续变化法测定金 属离子与原花青素的络合比例。
[0007] 所述的原花青素溶液为0.05-1. OmM原花青素甲醇-水溶液，甲醇和水的体积比为 1:1〇
[0008] 金属离子溶液的浓度为0.05-1. OmM。
[0009] 荧光淬灭实验中以280nm为激发波长λ0Χ，在荧光光谱仪上记录290-500nm波长范围 内的发射光谱。
[0010]所述的络合反应的结合常数Ksv的计算是在320nm波长下，将反应溶液相对荧光强 度变化值Fo/F对加入的金属离子含量作图，得到金属离子对原花青素的荧光淬灭Stern-Volmer曲线，由淬灭曲线求得不同金属离子与原花青素的络合物的络合常数K sv。
[0011] 所述的金属离子包括Sn2+，Zn2+，Cu2+，Al3+。
[0012] 所述缓冲液PH 6.0为最佳反应条件。
[0013] 有益效果：
[0014] 本发明利用金属离子对原花青素结构单元上酚羟基的荧光淬灭作用来定量分析 原花青素与不同金属离子的络合能力。原花青素与金属离子的络合反应受反应液pH值影响 较大，经条件优化得到pH 6为最佳反应条件，在此pH值下原花青素与金属离子络合能力最 强。在pH 6的缓冲液中加入原花青素溶液，用金属离子溶液进行荧光淬灭滴定实验，根据反 应溶液荧光强度的衰变曲线，利用Stern-Volmer荧光淬灭方程计算得到原花青素与金属离 子络合反应的结合常数;利用Job's法测定金属离子与原花青素的络合比例。本发明方法使 用鉴定的荧光检测仪器检测荧光，不需要使用昂贵的大型分析仪器，检测性能优异，检测时 间短、灵敏度高，是一种简便、快速、成本低、应用范围广的定量分析原花青素(缩合单宁)络 合金属离子能力的分析方法。
【附图说明】
[0015] 图1为不同浓度Sn2+和Al3+对高粱原花青素(PC)的荧光淬灭图谱Xex，280nm;c(PC)， 1.67yM;c(Sn 2+)(a-k)，0.0,0.05,0.1，0.15,0.2,0.25,0.3,0.35,0.4,0.45,0.5yM·;其中A 图为Sn2+、B图为Al3+的图谱。
[0016] 图2 Sn2+和Al3+对高粱原花青素（PC)的荧光淬灭Stern-Volmer曲线图，c(PC)， 1·67μΜ〇
[0017] 图3示51!2+，21!2+，〇12+，八1 3+分别与高粱原花青素(？〇络合物化学计量比测定(加13'8 法)。
【具体实施方式】
[0018] 本发明实施例公开了一种荧光淬灭法测定原花青素络合金属离子的定量分析方 法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0019] -种荧光淬灭滴定技术对原花青素络合金属离子的定量分析方法，
[0020] 1.荧光光谱的测定:移取2900-2990yL醋酸盐缓冲溶液(pH 6)于lcm石英池中，加 入10-100yL浓度范围为0.05-1. OmM原花青素甲醇-水(体积比1:1)溶液，充分混匀后用可调 式移液器逐次加入浓度范围为0.05-1. OmM金属离子0.1M盐酸溶液进行滴定反应，每次加入 后混合均匀，以280nm为激发波长(λΜ)，在荧光分光光度计上记录290-500nm波长范围内的 发射光谱。
[0021] 2.络合反应的结合稳定常数(Ksv)计算:在320nm波长下，将反应液相对荧光强度变 化值(F〇/F)对金属离子浓度作图，可得到金属离子对原花青素的荧光淬灭Stern-Volmer曲 线，由淬灭曲线求得不同金属离子与原花青素的络合物的络合稳定常数(K sv)。
[0022] 3.络合物组成比例测定：利用等摩尔连续变化法(又称Job's法)测定络合物中金 属离子与原花青素的化学计量比。
[0023]所述缓冲液pH为4-9,经过优化最终选择pH 6为最佳反应条件。
[0024] 实验仪器:Hitachi 850型荧光分光光度计（日本日立公司）
[0025] 荧光光谱的测定:移取2900yL醋酸盐缓冲溶液(pH 6)于lcm石英池中，加入100yL 浓度为〇. 〇5μΜ高粱原花青素(PC)甲醇-水（1:1)溶液，充分混匀后用可调式移液器逐次加入 浓度为〇.〇5μΜ金属离子盐酸(0.1M)溶液进行荧光滴定，每次加入金属离子溶液量为3yL，每 次加入溶液后混合均匀，以280nm为激发波长(λ Μ)，在Hitachi 850型荧光分光光度计上记 录290-500nm波长范围内的发射光谱。
[0026] 络合反应结合常数(Ksv)的计算：由于金属离子对原花青素荧光的淬灭是分子碰撞 引起的动态淬灭，按照St ern-Vo lmer方程有：
[0027] Fo/F= 1+KsvX [Q] = l+kq X τ〇 X [Q] (1)
[0028] 其中Fo为[Q]=0时的荧光强度，F为淬灭剂存在时的荧光强度，kq为双分子淬灭速 率常数，τ〇为淬灭剂不存在时物质的荧光寿命，K sv为动态淬灭常数，[Q]为淬灭剂（金属离 子)的浓度，则有Ksv = kqTQ。在荧光淬灭波长下，将Fo/F对金属离子浓度作图，可得到金属离 子对原花青素的焚光淬灭的Stern-Volmer曲线，原花青素对不同金属离子的络合能力不 同，所得到的原花青素淬灭曲线的斜率不同，可由淬灭曲线求得不同金属离子与原花青素 的络合物的络合稳定常数(K sv)。络合物中原花青素与金属离子摩尔比例的测定:等摩尔连 续变化法(又称Job ' s法)可用于测定络合组成比例，即配制等浓度的金属离子溶液和原花 青素溶液，保持反应液中金属离子溶液[Q]与配位体溶液[P ]的分析浓度同时变化，但二者 总和保持不变，即[Q] + [P] = [C](其中巧]=[(：狀，[0] = [(：](11)3=[?]/[(：](^为摩尔分 数）。测定淬灭剂(金属离子)加入反应溶液前后的荧光强度变化值（A F = FPe-FPe+me3tai)，将 AF对摩尔分数(X)作图得到AF变化曲线图。由曲线图中AF最大值对应的摩尔分数(X)BP 可计算出络合物的组成比例。
[0029] 为进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0030] 实施例1
[0031] 实验仪器:Hitachi 850型荧光分光光度计（日本日立公司）
[0032] 荧光光谱的测定:移取2900yL醋酸盐缓冲溶液(pH 6)于lcm石英池中，加入100yL 浓度为〇. 〇5μΜ高粱原花青素(PC)，充分混匀后用可调式移液器逐次加入浓度为0.05μΜ Sn2+ 0.1M盐酸溶液进行荧光滴定，每次加入Sn2+量为3yL，每次加入溶液后混合均匀，以280nm为 激发波长(λ ΘΧ)，在Hitachi 850型荧光分光光度计上记录290-500nm波长范围内的发射光谱 (图 1)。
[0033] 络合反应的结合常数(Ksv)计算:按照Stern-Volmer方程（1)在320nm波长下，将Fo/ F对Sn2+浓度作图，可得到Sn2+对原花青素的荧光淬灭的Stern-Volmer曲线（图2)，由淬灭曲 线求得Sn 2+与原花青素的络合物的络合稳定常数(Ksv)为1.44X106L πιοΓ1。
[0034]络合物中原花青素与金属离子摩尔比例的测定:利用Job's法测定络合组成比例， 即配制0.05μΜ金属离子溶液和0.05μΜ原花青素溶液，按照不同摩尔分数(X)进行Sn2+荧光淬 灭滴定实验。测定滴定前后反应溶液的荧光强度变化值（A F = FPC-FPC+metai)，将△ F对摩尔 分数⑴作图得到AF变化曲线图（图3)。由MatLab软件计算出曲线中的极值，即可计算出络 合物的化学计量比，由此可知络合物中Sn 2+: PC的摩尔比例为1:1 (表1)。
[0035]表1高粱原花青素(PC)与金属离子络合反应的定量分析结果
[0037] 实施例2
[0038] 荧光光谱的测定:按照实施例1所述步骤，将Al3+对高粱原花青素(PC)进行荧光淬 灭滴定反应，在Hitachi 850型荧光分光光度计上记录290-500nm波长范围内的发射光谱 (图 1)。
[0039]络合反应的结合常数(Ksv)计算:按照Stern-Volmer方程（1)在荧光淬灭波长下，将 F〇/F对Al3+浓度作图，可得到Al3+对原花青素的荧光淬灭的Stern-Volmer曲线（图3)，由淬灭 曲线求得Al 3+与原花青素的络合物的络合稳定常数(Ksv)为1.35 X 106L πιοΓ1。
[0040]络合物化学计量比的测定：按照实施例1中所述步骤，利用Job's法测定络合组成 比例，将AF对摩尔分数(X)作图得到AF变化曲线图（图3)。由MatLab软件计算出曲线中的 极值，即可计算出络合物的化学计量比，由此可知络合物中A1 3+:PC的摩尔比例为1:2(表1)。 [0041 ] 实施例3
[0042]荧光光谱的测定:按照实施例1所述步骤，移取2900yL pH 6醋酸盐缓冲溶液于lcm 石英池中，加入100uL浓度为0.25μΜ高粱原花青素(PC)，充分混匀后用可调式移液器逐次加 入浓度为〇. 25μΜ Zn2+0.1M盐酸溶液进行荧光滴定，每次加入Zn2+量为3yL，每次加入溶液后 混合均匀，以280nm为激发波长(λ ΘΧ)，在Hitachi 850型荧光分光光度计上记录290-500nm波 长范围内的发射光谱。
[0043]络合反应的结合常数(Ksv)计算:按照Stern-Volmer方程(1)在荧光淬灭波长下，将 F〇/F对加入的Zn2+浓度作图，可得到Zn2+对原花青素的焚光淬灭的Stern-Volmer曲线，由淬 灭曲线求得Zn2+与原花青素的络合物的络合稳定常数(Ksv)为0.29 X 106L πιοΓ1。
[0044] 络合物化学计量比的测定：按照实施例1中所述步骤，利用Job's法测定络合组成 比例，将AF对摩尔分数(X)作图得到AF变化曲线图（图3)。由MatLab软件计算出曲线中的 极值，即可计算出络合物的化学计量比，由此可知络合物中Zn 2+:PC的摩尔比例为1:2(表1)。
[0045] 实施例4
[0046] 荧光光谱的测定:按照实施例1所述步骤，移取2900yL pH 6醋酸盐缓冲溶液于lcm 石英池中，加入100uL浓度为0.25μΜ高粱原花青素(PC)，充分混匀后用可调式移液器逐次加 入浓度为〇. 25μΜ Cu2+0.1M盐酸溶液进行荧光滴定，每次加入Cu2+量为3yL，每次加入溶液后 混合均匀，以280nm为激发波长(λ Μ)，在Hitachi 850型荧光分光光度计上记录290-500nm波 长范围内的发射光谱。
[0047]络合反应的结合常数(Ksv)计算:按照Stern-Volmer方程(1)在焚光淬灭波长下，将 F〇/F对Cu2+浓度作图，可得到Cu2+对原花青素的焚光淬灭的Stern-Volmer曲线，由淬灭曲线 求得Cu 2+与原花青素的络合物的络合稳定常数(Ksv)为0.32 X 106L πιοΓ1。
[0048] 络合物化学计量比的测定：按照实施例1中所述步骤，利用Job's法测定络合组成 比例，将AF对摩尔分数(X)作图得到AF变化曲线图（图3)。由MatLab软件计算出曲线中的 极值，即可计算出络合物的化学计量比，由此可知络合物中Cu 2+:PC的摩尔比例为1:2(表1)。
[0049] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行 若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，其特征在于，在pH 4-9的 醋酸盐缓冲液中加入原花青素溶液，用金属离子溶液进行荧光淬灭滴定实验，根据反应溶 液荧光强度的衰变曲线，利用Stern-Volmer荧光淬灭方程计算得到原花青素与金属离子络 合反应的结合常数;利用等摩尔连续变化法测定金属离子与原花青素的络合比例。2. 根据权利要求1所述的荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，其特征 在于，所述的原花青素溶液为0.05-1.OmM原花青素甲醇-水溶液，甲醇和水的体积比为1:1。3. 根据权利要求1所述的荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，其特征 在于，金属离子溶液的浓度为〇. 05-1. OmM。4. 根据权利要求1所述的荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，其特征 在于，荧光淬灭实验中以280nm为激发波长λ Μ，在荧光光谱仪上记录290-500nm波长范围内 的发射光谱。5. 根据权利要求1所述的荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，其特征 在于，所述的络合反应的结合常数Ksv的计算是在320nm波长下，将反应溶液相对荧光强度变 化值F〇/F对加入的金属离子含量作图，得到金属离子对原花青素的焚光淬灭Stern-Volmer 曲线，由淬灭曲线求得不同金属离子与原花青素的络合物的络合常数Ksv。6. 根据权利要求1所述的荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，其特征 在于，所述的金属离子包括Sn2+，Zn 2+，Cu2+，Al3+。7. 根据权利要求1所述的荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，其特征 在于，所述缓冲液pH 6.0为最佳反应条件。
【文档编号】G01N21/64GK106018356SQ201610289428
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】张亮亮, 汪咏梅, 徐曼, 胡新宇
【申请人】中国林业科学研究院林产化学工业研究所