食品中禁用偶氮染料快速检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明提供一种操作简便、快捷、无需额外设备，而且灵敏度高的食品中禁用脂溶性偶氮染料快速检测试剂盒及其检测方法。包含：1)还原试剂1：0.06mol/L pH6.0柠檬酸盐缓冲液5mL；2)还原试剂2：连二亚硫酸钠1g；3)提取试剂A：甲基叔丁醚，4mL；3)提取试剂B：1mol/L盐酸溶液，2mL；4)试剂1：50g/L NaNO2溶液，0.05mL；5)试剂2：25g/L NH4SO3NH2溶液；6)试剂3：2g/L盐酸萘乙二胺溶液，0.05mL；7)试剂4：60g/L的尿素溶液，0.05mL。本发明根据偶氮染料被还原降解成无色的芳香胺，芳香胺经重氮耦合反应后生成偶氮化合物显色的原理，通过化学反应显色快速判定食品中是否含有脂溶性偶氮染料。具有操作简便、快速、成本低廉的优点。
【专利说明】
食品中禁用偶氮染料快速检测试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种用于食品中禁用偶氮染料检测的快速筛查检测方法。本发明无需 色谱仪器分离，运用化学方法直接显色测定食品中禁用偶氮染料，用于食品禁用偶氮染料 的快速筛查。
【背景技术】
[0002] 目前，化学合成工业染料有几千种，其中大部分为偶氮染料，广泛应用于工业生产 纺织品、皮毛制品、木制品已及陶瓷制品的着色。运些染料色谱齐全、色泽鲜艳、价格低廉、 不易稱色。食品安全国家标准食品添加剂使用标准GB 2760-2011中只有巧樣黄、姻脂红、 日落黄等几种水溶性合成色素被允许用作食品添加剂，并对其使用范围和用量有严格的限 定。全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治领导小组陆续发布了六批 《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》，把频频出现在食品中的 苏丹红、对位红等其他偶氮类工业染料视为违法添加的非食用物质。
[0003] 偶氮类工业染料大部分含有芳香结构，可在人体内代谢分解产生芳香胺类物质， 而大多数芳香胺类物质可诱发人体癌变或引起人体皮肤、黏膜或呼吸道过敏的致癌和致 敏，具有高毒性、高残留和致"（致崎、致癌、致突变）等副作用。尤其是苏丹红染料进 入人体后，在还原酶的作用下代谢产生相应的胺类。国际癌症研究机构（IARC)将苏丹红类 及其代谢产物列为二类或=类致癌物。而偶氮类工业染料非法添加到食品的事件频发，自 2003年欧盟首次在辣椒粉中检测出苏丹红I，各国陆续在食品中发现了各种工业染料，例 如：2005年2月英国发现350多种食品收"苏丹红I号"污染之后，英国食品标准局又公布 了在35种食品中发现"对位红"，国内监管部口发现豆腐加工过程中使用量碱性澄II，火锅 底料中检出罗丹明B，冷冻邮仁中检出了酸性红染料。因此为防止及监测工业染料在食品中 的滥用，必需建立快速准确的检测方法，W保障食品安全和消费者健康。
[0004] 目前检测食品中非法添加的偶氮类工业染料的方法很多，包括高效液相色谱法、 气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、薄层色谱法、电化学分析法、毛细管电泳法 和免疫法等。其中常用的方法是高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。由于偶氮类工 业染料的种类比较多，不法经营者使用的染料不尽相同，目前国标方法和文献报道的检测 方法不能完全囊括多种偶氮染料，虽然能满足日常检查要求，但是遇到重大食品安全突发 事件，就无法在短时间内完成多种目标化合物的快速筛查工作，给食品检测和卫生监管部 口的执法带来了很大的困难。快速筛查工作需要方法通用性强、选择性好、灵敏度高、便捷 省时。建立一种能涵盖大部分脂溶性偶氮类化合物的快速筛选检测方法是十分必要的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种操作简便、快捷、无需额外设备，而且灵敏度高的食品 中禁用偶氮染料快速检测试剂盒及其检测方法。
[0006] 本发明的基本原理为：偶氮染料被还原降解成无色的芳香胺，芳香胺经重氮禪合 反应后生成偶氮化合物显色。利用运一原理，将食品中的偶氮染料还原后，萃取芳香胺化合 物，再在合适的条件下转化成偶氮化合物显色，根据有无颜色及颜色的深浅快速判定食品 中是否含有偶氮染料。 阳007] 本发明的试剂盒包括：
[0008] 1、还原试剂1 :0. 06mol/L P册.0巧樣酸盐缓冲液5血；配制方法：称取巧樣酸 12. 526g和氨氧化钢6. 320g溶于1000 mL水中；
[0009] 2、还原试剂2 :连二亚硫酸钢Ig ;
[0010] 3、提取试剂A :甲基叔下酸，4mL ; 阳0川 4、提取试剂B : Imol/L盐酸溶液，2血；
[0012] 5、试剂 1 :50g/L NaN〇2溶液； 阳01引 6、试剂 2 :50 ~200g/L NH4SO3NH2溶液；
[0014] 7、试剂3 :2g/L盐酸糞乙二胺溶液；
[0015] 8、试剂4 :60g/L的尿素溶液。
[0016] 本发明的检测方法步骤如下：
[0017] 1)样品提取：取样品5g，加10血水分散，再加入10血正己烧萃取，吸取有机相 4mU挥干，用4血乙腊溶解，作为测试液待用； 阳0化]。样品还原：加入5血还原试剂1和Ig还原试剂2,密闭，用力振摇，置于70°C水 浴中保溫30min，取出后迅速冷却至室溫；
[0019] 3)萃取脱色：还原液中加入提取试剂A 411心用力振摇，静置分层，取上层液2血于 装有2mL提取试剂B的反应瓶中，用力振摇，静置分层，取下层溶液ImL置于空反应瓶中；
[0020] 4)显色：在空反应瓶中分别加入试剂1、试剂2、试剂3、试剂4各一滴，每加一种试 剂都要充分摇匀，立即观察溶液颜色的变化；
[0021] 5)筛选判定：如果样品溶液显色后颜色发生明显变化，即可判定为阳性样品，通 过色谱仪器进一步确认；否则为阴性样品，直接判定为合格。
[0022] 本发明的工作原理为：通过还原和脱色处理，利用重氮偶合反应显色测定芳香胺， 简单、快捷、成本低廉，无需任何仪器设备，实现了食品中禁用偶氮染料检测的快速筛查。
【具体实施方式】 阳〇2引试剂的配制：
[0024] (1)亚硝酸钢溶液巧Og/L):称取5. Og NaN02,用水溶解，定容至100血； 阳〇2引 似盐酸（1. Omol/L):量取5血盐酸，用水稀释至60血；
[0026] 做尿素溶液（60g/L):称取6. Og尿素，用水溶解，定容至100血；
[0027] (4)盐酸糞乙二胺溶液（2g/L):称取0.2g盐酸糞乙二胺，用水溶解，定容至 100 血；
[0028] (5)化OH溶液（lOg/L):称取IOg化0H，用水溶解，定容至100血；
[0029] (6)对氨基苯横酸溶液（lOOg/L):称取5~20g NH4SO3NH2,用水溶解，定容至 10OmT,;
[0030] 具体检测步骤如下：
[0031] 1)样品提取：取样品5g，加10血水分散，再加入10血正己烧萃取，吸取有机相 4mU挥干，用4血乙腊溶解，作为测试液待用； 阳03引。样品还原：加入5血还原试剂1和Ig还原试剂2,密闭，用力振摇，置于70°C水 浴中保溫30min，取出后迅速冷却至室溫；
[0033] 3)萃取脱色：还原液中加入提取试剂A 411心用力振摇，静置分层，取上层液2血于 装有2mL提取试剂B的反应瓶中，用力振摇，静置分层，取下层溶液ImL置于空反应瓶中；
[0034] 4)显色：在空反应瓶中分别加入试剂1、试剂2、试剂3、试剂4各一滴，每加一种试 剂都要充分摇匀，立即观察溶液颜色的变化；
[0035] 筛选判定：如果样品溶液显色后颜色发生明显变化，即可判定为阳性样品，通过色 谱仪器进一步确认；否则为阴性样品，直接判定为合格。
[0036] 实施实例1
[0037] 市售辣椒酱、番茄酱、咸蛋黄、熟肉，自制辣椒粉（经高压液相色谱检测，已知不含 苏丹红、对位红等偶氮染料），分别取样品5g，各加 IOmL水分散，再加入5mL正己烧萃取，吸 取有机相ImU挥干，用ImL乙腊溶解，作为测试液待用。
[0038] 按照实施方式第2~4步骤进行反应。
[0039] 反应液颜色没有变化，由此判定样品中无脂溶性偶氮染料，为阴性。 W40] 实施实例2
[0041] 取实施实例1中的市售辣椒酱、番茄酱、咸蛋黄、熟肉，自制辣椒粉样品适量，分别 加入苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV W及对位红标准溶液，拌匀，制成含标准色 素 0.1 mg/kg样品。
[0042] 按照实施方式第2~4步骤进行反应。
[0043] 观测到反应液显紫色，由此判定样品含无脂溶性偶氮染料，为阳性。
[0044] 实施实例3
[0045] 取实施实例1中自制辣椒粉（阴性样品），按照实施实例1中的样品提取步骤提 取，制成测试液。在测试液中分别加入苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV和对位红 标准溶液，使测试液中标准溶液浓度分别为0,0. 1，0. 5,1，5, lOmg/kg。
[0046] 按照实施方式第2~4步骤进行反应，反应液在540nm波长处检测吸光度，根据添 加标准品浓度和对应的吸收度，绘制5种偶氮染料的标准曲线，计算相关线性方程。
[0047] 5种偶氮染料显色反应的标准曲线 [00481
W例实施实例4
[0050] 在辣椒酱、番茄酱、咸蛋黄、熟肉，自制辣椒粉中分别添加不同浓度苏丹红I、苏丹 红II、苏丹红III、苏丹红IV和对位红标准溶液，使样品中标准溶液浓度分别为0. 01，0. 02， 0. 03,0. 05,0.1 mg/g拌匀，按照实施实例1步骤处理测定。
[0051] 实验结果表明在上述样品添加量下，反应液均有变化，可W明显观察到反应液变 紫色，说明含量在lOmg/kg时，样品反应液颜色变化明显，能够准确判断为阳性样品。
【主权项】
1. 一种用于食品中禁用脂溶性偶氮染料检测的快速筛查检测方法，其特征在于它包 括： 1) 样品提取：取样品5g，加10mL水分散，再加入10mL正己烷（环己烷、丙酮、氯仿或几 种有机溶剂混合物）萃取，吸取有机相4mL，挥干，用4mL乙腈溶解，作为测试液待用； 2) 样品还原：加入5mL还原试剂1和lg还原试剂2,密闭，用力振摇，置于70°C水浴中 保温30min，取出后迅速冷却至室温； 3) 萃取脱色；还原液中加入提取试剂A4mL，用力振摇，静置分层，取上层液2mL于装有 2mL提取试剂B的反应瓶中，用力振摇，静置分层，取下层溶液lmL置于空反应瓶中； 4) 显色：在空反应瓶中分别加入试剂1、试剂2、试剂3、试剂4各一滴，每加一种试剂都 要充分摇匀，立即观察溶液颜色的变化； 5) 筛选判定：如果样品溶液显色后颜色发生明显变化，即可判定为阳性样品，通过色 谱仪器进一步确认；否则为阴性样品。2. -种用于食品中禁用脂溶性偶氮染料检测的快速检测试剂盒， 1) 还原试剂1 06111〇1/1。？册.0柠檬酸盐缓冲液5mL ;配制方法：称取柠檬酸12. 526g 和氢氧化钠6. 320g溶于lOOOmL水中； 2) 还原试剂2 :连二亚硫酸钠 lg ; 3) 提取试剂A :甲基叔丁醚，4mL ; 4) 提取试剂B : lmol/L盐酸溶液，2mL ; 5) 试剂 1 :50g/L NaN02溶液； 6) 试剂 2 :50 ~200g/L NH4S03NH2溶液； 7) 试剂3 :2g/L盐酸萘乙二胺溶液； 8) 试剂4 :60g/L的尿素溶液。3. 如权利要求2所述的快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂2浓度：50~200g/L NH4S03NH 2 溶液。4. 如权利要求2所述的快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂3浓度：2g/L盐酸萘乙 二胺溶液。
【文档编号】G01N21/78GK105987901SQ201510046661
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月27日
【发明人】李利东, 陆茂林, 宓晓黎, 黄丽俊, 沈依群, 袁建兴, 杜姝莲, 司竑飞, 张晓来, 钱国芬, 许春燕
【申请人】江苏省微生物研究所有限责任公司