食品低致敏加工方式的筛选方法
【专利摘要】食品低致敏加工方式的筛选方法，是将食品蛋白以不同方式经过熟制加工后，提取蛋白，与体外模拟消化液混合后，以SDS?PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物，根据耐酶解条带的多少判断不同加工方式下食品的致敏性，筛选出获得低致敏食品的加工方式。本发明的筛选方法不经过复杂的过敏原检测手段，利用食品是否耐模拟胃液消化来反应其潜在致敏性，结合生活实际，确定食品低致敏熟制加工方式，操作简单，结果显著，且可信度高，重复性强。
【专利说明】
食品低致敏加工方式的筛选方法
技术领域
[0001] 本发明涉及食品的低致敏性加工方法，属于食品加工领域。
【背景技术】
[0002] 食品过敏指的是人体免疫系统对食品中的某种物质产生了免疫反应，包括抗体的 释放，而这些抗体又引起人体内某些化学物质释放，例如组胺会引起皮肤发痒、流鼻涕、咳 嗽、呼吸困难，甚至导致死亡(张瑞灏等，中国检验检疫，2009,3: 22)。除牛奶、蛋类以及坚果 等常见的陆地食物过敏原外，鱼类等水产品过敏原同样占据了非常大的比重。
[0003] 采用一定的加工方式，可在过敏食物被食用前改变其中过敏原表位的特性，从而 降低某些食物的致敏性。但是，加工处理对不同食物过敏原的影响存在很大差异，如热处理 可以破坏蔷薇科果实的致敏性，也能部分影响大豆、坚果、猕猴桃、鸡蛋、虾等过敏原的稳定 性[郑礼娜，林洪，等.不同热加工方式对刀额新对虾过敏原活性的影响.水产学报，2011，35 (2) :466-471 ·]，而牛奶、花生等致敏食物的热稳定性却很好[Tong P，Gao J Y，et al .Food Chemistry,2012,131(2):603-610.Cabanillas B,Maleki S J,et al.Food Chemistry, 2012，132( 1): 360-366.];高压处理能够有效地降低乳清蛋白的致敏性及消化稳定性[Chic ?η R，Belloque J，et al.Int Dairy 了，2008，18(4):367-376.];牛乳中的过敏原€[-乳白蛋 白与葡萄糖反应后，美拉德反应能明显降低其免疫活性[Bu G，Lu J，et al.J Sci Food Agric，2009,89(14)2428-2434.8] Jstwood等人发现食品中的大部分过敏原具有含量高、 在体内胃液酸性环境中很难被胃蛋白酶水解（A s t w ο 〇 d J . D .，e t a 1 . N a t u r e Biotechnology 1996,14:1269)，该发现说明过敏原与耐胃液消化蛋白质具有一定的相关 性。所以采用模拟胃液消化来评价不同加工方式对食物过敏性的影响，具有一定的实用价 值，可为进一步开发低致敏性制品尤其是水产制品提供理论参考。
【发明内容】
[0004] 为解决现有技术中没有快速有效的评估加工低致敏食品的方法，本发明拟提供一 种食品低致敏加工方式的筛选方法，判断不同的熟制加工方式下食品的致敏性，筛选出获 得低致敏食品的加工方式。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供一种食品低致敏加工方式的筛选方法，是将食品 蛋白以不同方式经过熟制加工后，提取蛋白，与体外模拟消化液混合后，以SDS-PAGE电泳分 析不同消化时间条件下的消化产物，根据耐酶解条带的多少判断不同加工方式下食品的致 敏性，筛选出获得低致敏食品的加工方式。
[0006] 本发明食品加工方式的筛选方法不经过复杂的过敏原检测手段，利用食品是否耐 模拟胃液消化来反应其潜在致敏性，结合生活实际，确定食品低致敏熟制加工方式，操作简 单，结果显著，且可信度高，重复性强。
【附图说明】
[0007]图1是大黄鱼蛋白质(未加工)的模拟胃液消化产物的SDS-PAGE电泳图；
[0008]图2是大黄鱼蛋白质（蒸)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图； [0009]图3是大黄鱼蛋白质（煮)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图； [0010]图4是大黄鱼蛋白质(烤)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图； [0011]图5是带鱼蛋白质（未加工）经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳 图；
[0012]图6是带鱼蛋白质（蒸)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图； [0013]图7是带鱼蛋白质（煮)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图； [0014]图8是带鱼蛋白质(烤)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图； [0015]图9是金鲳鱼蛋白质（未加工）经过不同时间的体外模拟胃液酶解SDS-PAGE电泳 图；
[0016]图10是金鲳鱼蛋白质（蒸)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图； [0017]图11是金鲳鱼蛋白质（煮)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图； [0018]图12是金鲳鱼蛋白质(烤)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图。
【具体实施方式】
[0019] 本发明所述的食品低致敏加工方式的筛选方法，是将食品蛋白以不同方式经过熟 制加工后，提取蛋白，与体外模拟消化液混合后，以SDS-PAGE电泳分析不同消化时间条件下 的消化产物，根据耐酶解条带的多少判断不同加工方式下食品的致敏性，筛选出获得低致 敏食品的加工方式。
[0020] 本发明所述的食品低致敏加工方式的筛选方法实施的重要基础之一，是依赖于耐 酶解条带与食品过敏原的相关性。现有技术的众多研究表明，过敏原与耐酶解胃液消化蛋 白质具有一定的相关性，据此，有关于过敏原与耐酶解条带的关系，可根据如下实验步骤进 行验证:将食品蛋白与体外模拟消化液混合后，以SDS-PAGE电泳分析不同消化时间条件下 的消化产物;选取耐酶解条带进行胶内酶解，所得肽段采用液相色谱-质谱联用鉴定分析， 并结合蛋白质数据库和过敏原数据库，确定致敏蛋白质种类及其过敏性。
[0021] 以大黄鱼为例，将其蛋白样品与体外模拟消化液混合后，进行体外模拟消化液混 合后，可确定其耐酶解条带为47kD，42kD和12kD条带，对三种耐酶解条带进行胶内酶解，采 用液相色谱-质谱联用进行分析，结合蛋白质数据库进行鉴定。三种条带的结果分别为：（1) 大黄鱼中稀醇化酶，与已知武昌鱼(Megalobramaamblycephala)中过敏原稀醇化酶同源性 为95% (Identities 410/433(95% )，E valueO.O)，说明该蛋白质过敏性较高；（2)大黄鱼 中肌酸激酶Μ与已知武昌鱼中过敏原肌酸激酶同源性为89% (Identities 335/377(89% )， E valueO.O)，说明该蛋白质过敏性较高；（3)大黄鱼中原肌球蛋白α-l与已知过敏原pen a 1 同源性为55%(Identities 145/265(55%)，E value2e-75)。该蛋白与pen a 1 三个已鉴 定的表位都有超过6个连续的氨基酸序列相同，分别为:AADESER，AEEADRKY和FAERSV，说明 该蛋白质过敏性较高。
[0022] 在其他鱼类蛋白的实验中也得出类似的结果，由以上结果显示，食品过敏原与其 耐酶解胃液消化蛋白质具有一定的相关性，在实际应用中，可依照耐酶解蛋白的结果判断 食品的过敏原及致敏性。
[0023] 在上述本发明所述的食品低致敏加工方式的筛选方法中，所述的体外模拟消化液 是体外模拟胃液或体外模拟肠液。在食品蛋白与体外模拟消化液混合过程中，优选控制体 外模拟消化液中的酶与食品蛋白的质量比是1:40~60。作为更进一步的优选，所述的体外 模拟消化液是含有胃蛋白酶的体外模拟胃液，胃蛋白酶与食品蛋白的质量比是1:50。
[0024] 在上述筛选方法中，作为优选，所述食品蛋白是鱼源性食品蛋白。
[0025] 在上述筛选方法中，所述的食品蛋白是采用等电点沉淀法、缓冲盐提取法或有机 溶剂提取法从食物样品中提取，并经冷冻干燥处理的混合蛋白样品。
[0026]在上述筛选方法中，所述的熟制加工包括蒸、煮、烤和/或高压处理。
[0027]为使本领域技术人员更容易理解本发明，上述筛选方法更为具体的操作步骤如 下：
[0028] (1)将食品蛋白以蒸、煮、烤或高压处理等方式加工后，采用等电点沉淀法、缓冲盐 提取法或有机溶剂提取法从加工后的食物样品中提取蛋白；
[0029] (2)将步骤(1)中提取的蛋白与含有胃蛋白酶的体外模拟胃液混合，使胃蛋白酶与 食品蛋白的质量比是1:50;
[0030] (3)消化反应在37 °C条件下震荡进行，分别在消化反应0、5、15、30、60、90和120分 钟，进行SDS-PAGE电泳分析；
[0031] (4)根据步骤(3)的结果，确定电泳结果的耐酶解条带的数量，由此筛选出获得低 致敏食品的最佳加工方式。
[0032]以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的【具体实施方式】。
[0033] 实施例1
[0034] 本实施例是针对大黄鱼中耐酶解条带与过敏原对应关系的实验。
[0035] 1、大黄花鱼蛋白质的提取
[0036]取洗净的大黄鱼肌肉300g，用搅拌机将大黄花鱼肌肉绞碎，再用均质机将绞碎的 鱼肉进行均质，加入7倍体积的水后，用盐酸将PH值调至2.4左右，使蛋白质大部分溶解，在 5000以1^11条件下，离心151^11，收集上清液。再用氢氧化钠溶液将上清液的?!1值调至4.75左 右，使蛋白质沉淀，在5000r/min下，离心15min，收集蛋白质沉淀，将其冷冻干燥以备用。 [0037] 2.体外模拟胃液消化
[0038] 模拟胃液:称取0.1 gNaCI于50ml蒸馏水中，用HC1调pH至1.2，加入胃蛋白酶，使胃 蛋白酶的质量浓度为150ug/ml。
[0039] 同样方法制备对照溶液，与模拟胃液区别在于仅不含胃蛋白酶。
[0040] 取离心管，其中一支加入模拟胃液，另一支加入同体积对照溶液，分别设置平行样 品。在37°C条件下预热15分钟后，将所提取的大黄花鱼蛋白质加入上述离心管中混合均匀， 使胃蛋白酶与大黄鱼蛋白的质量比例为1:50,总反应体系为lml。消化反应在37°C条件下震 荡进行，分别在消化反应0、2、10、30、60、90和120分钟时取出100111反应液于离心管中，迅速 与30ul 200mM Na2C03溶液混合均匀，使其达到碱性，终止反应，并迅速放入冰柜中。其中0分 钟样品是将含有胃蛋白酶的模拟胃液先与Na 2C03中和终止反应，再加入同等量的大黄鱼蛋 白。
[0041 ] 3. SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量及抗酶解性能
[0042]采用12.5%的分离胶对步骤2不同时间点取样的消化后产物进行分析，结果如附 图1所示。
[0043] 根据附图1可见:模拟胃液酶解120min后，仍然存在47kD，42kD和12kD条带的蛋白 质。在Omin时，42kD条带存在，47kD和12kD条带不存在。47kD，42kD和12kD三条条带的蛋白质 在120min以内随着酶解时间的增加浓度逐渐增加，这几个条带是相对耐酶解的蛋白质或肽 段。由此可见大黄鱼肌肉中耐酶解蛋白质是分子量为47kD，42kD和12kD的蛋白质。
[0044] 对上述确定的大黄鱼的耐酶解蛋白质条带进行胶内酶解，采用液相色谱-质谱联 用进行分析，结合蛋白质数据库进行鉴定。参数条件包括:纳升级高效液相色谱-串联质谱 分析在1^( >)-〇1'13；[1:抑口(1'1161'1]1〇,3311(17]〇86,3六)质谱系统中进行。其中，液相色谱(]18六( >)(34111， 120 A，12cm)分流后的流速约为200nl/min;离子传输毛细管的温度设置为200°C，电喷雾 电压设置为1.8kV。采用数据依赖模式(data-dependent mode，DDA)进行数据采集，每个循 环包括1个MS全扫描和10个MS/MS质谱扫描，MS全扫描在Orbitrap中采集，扫描范围为400-2000Da，分辨率为60000.二级质谱采集在LTQ中进行，采用CID碎裂方式，归一化碰撞能量为 35%。所收集的质谱文件通过Maxquant(version 1 · 3 ·0· 5)在蛋白质库中进行检索。结果如 表1所示：
[0045] 表1.大黄鱼蛋白质耐酶解条带通用液相色谱-质谱联用鉴定结果
[0046]
[0047]采用NCBI/blast数据库将鉴定到的大黄鱼蛋白质与已知过敏原或表位序列进行 比对，得到如下结果：
[0048] 1.大黄鱼中稀醇化酶与已知武昌鱼(Megalobramaamblycephala)中过敏原稀醇化 酶同源性为95% (Identities 410/433(95% )，E valueO.O)，说明该蛋白质过敏性较高。 [0049] 2 .大黄鱼中肌酸激酶Μ与已知武昌鱼中过敏原肌酸激酶同源性为89 % (Identities 335/377(89%)，E valueO.O)，说明该蛋白质过敏性较高。
[0050] 3.大黄鱼中原肌球蛋白α-l与已知过敏原pen a 1同源性为55% (Identities 145/265(55%)，E value2e-75)。该蛋白与pen a 1三个已鉴定的表位都有超过6个连续的 氨基酸序列相同，分别为:AADESER，AEEADRKY和FAERSV，说明该蛋白质过敏性较高。
[0051 ] 4.大黄鱼中小清蛋白与鲤鱼已知过敏原小清蛋白质同源性为79% (Identities 84/107(79% )，E valuele-51)。该蛋白与Gad cl已鉴定的 1 个表位(AGDSDGDGK，Elsay, Apold，1983)氨基酸序列完全一致相同。与sco j 1过敏原表位中8个连续氨基酸序列 (FFKACGLS) -致说明该蛋白质过敏性较高。
[0052]由实施例1的实验结果可知，食品过敏原与其耐酶解胃液消化蛋白质的相关性很 大，在实际应用中，可依照耐酶解蛋白的结果判断食品的过敏原及致敏性。
[0053]以下实施例分别为大黄鱼、带鱼、金鲳鱼低致敏加工方式的筛选方法实例。
[0054] 实施例2
[0055]将新鲜大黄鱼去头、尾、鳞和内脏。取带皮背部白肉30g/袋，4袋白肉分别做原样、 蒸、煮和烘烤处理。总共4组鱼肉样本。
[0056]原样处理：将30g鱼肉用冰蒸馏水洗净，沥干，绞碎后装入保鲜袋于_20°C冰箱备 用。
[0057]蒸样处理:将洗净的30g鱼肉放入沸水蒸锅中，自放入起计时15min后，绞碎后装入 保鲜袋于_20°C冰箱备用。
[0058] 煮样处理:将洗净30g鱼肉放入沸水锅中，自放入起计时15min后，用漏勺捞起，绞 碎后装入保鲜袋于_20°C冰箱备用。
[0059]烘烤处理:将洗净30g鱼肉放入锡箱纸中包好，在烘箱102 °C条件下烘烤2h，取出绞 碎后装入保鲜袋于_20°C冰箱备用。
[0060] 将4组鱼肉样品采用等电点提取法，即：匀浆、均质一制备可溶性蛋白液一等电点 析出蛋白质一冻干的步骤提取所需的4组蛋白质样品。
[0061] 体外模拟胃液消化
[0062] 将4组通过等电点法提取的鱼肉蛋白质样品，按照体外模拟消化实验的方法进行 模拟人体胃液消化，实验的反应时间更改为〇、5、15、30、60、90、120min共7组时间平行条件。 [0063] SDS-PAGE凝胶电泳方法，按照样品制备一制胶一电泳一染色一脱色一分析的步 骤，将制备好的蛋白质样液进行SDS-PAGE凝胶电泳实验。
[0064]图2~图4分别为大黄鱼蛋白质经蒸、煮、烤加工方式处理后经过不同时间的体外 模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图，未加工的大黄鱼蛋白质的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE 电泳图见附图1，其各种处理方式下蛋白质条带对比如表2所示。
[0065]表2大黄鱼各处理方式蛋白质条带对比
[0066]
[0067]从表2中我们可以得出：以过敏原的耐酶解性为依据，三种加工方式都使大黄鱼的 蛋白质得到了一定程度的降解，蛋白质条带明显减少，尤其是大分子的蛋白质，但均在体外 消化试验2h后，仍存在部分耐酶解的蛋白质。仅从剩余蛋白质条带的种类分析，对于大黄 鱼，烤和煮的加工方式优于蒸。
[0068] 实施例3
[0069]采用新鲜带鱼为研究对象，具体处理步骤同实施例2。
[0070]图5~图8分别为带鱼蛋白质在未加工、经蒸、煮、烤加工方式处理后经过不同时间 的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图，其各种处理方式下蛋白质条带对比如表3所示。
[0071] 表3带鱼各处理方式蛋白质条带对比
[0072]
[0073] 从表3中我们可以得出：以过敏原的耐酶解性为依据，三种加工方式蒸、煮和烘烤 的差别不大，虽然三种加工方式均使带鱼的蛋白质得到了一定程度的降解，蛋白质条带明 显减少，尤其是大分子的蛋白质，但部分条带在体外消化试验2h后，仍存在，说明其耐酶解 性质稳定。仅从剩余蛋白质条带的种类分析，对于带鱼，三种加工方式对耐酶解蛋白质的影 响程度相似。
[0074] 实施例4
[0075] 采用新鲜金鲳鱼为研究对象，具体处理步骤同实施例2。
[0076]图9~图12分别为金鲳鱼蛋白质在未加工、经蒸、煮、烤加工方式处理后经过不同 时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图，其各种处理方式下蛋白质条带对比如表4所 不。
[0077] 表4金鲳鱼鱼各处理方式蛋白质条带对比
[0078]
[0079]从表4中我们可以得出：以过敏原的耐酶解性为依据，三种加工方式都使金鲳鱼的 蛋白质得到了一定程度的降解，其蛋白质条带明显减少，尤其是大分子的蛋白质，但均在体 外消化试验2h后，仍存在部分耐酶解的蛋白质。仅从剩余蛋白质条带的种类分析，对于金鲳 鱼而言，烤和蒸的加工方式优于煮。
【主权项】
1. 食品低致敏加工方式的筛选方法，是将食品蛋白以不同方式经过熟制加工后，提取 蛋白，与体外模拟消化液混合后，以SDS-PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物，根 据耐酶解条带的多少判断不同加工方式下食品的致敏性，筛选出获得低致敏食品的加工方 式。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的体外模拟消化液是体外模拟胃液或 体外模拟肠液。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的体外模拟消化液中的酶与食品蛋白 的质量比是1:40~60。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的体外模拟消化液是含有胃蛋白酶的 体外模拟胃液，胃蛋白酶与食品蛋白的质量比是1:50。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述食品蛋白是鱼源性食品蛋白。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的食品蛋白是采用等电点沉淀法、缓 冲盐提取法或有机溶剂提取法从食物样品中提取，并经冷冻干燥处理的混合蛋白样品。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的熟制加工包括蒸、煮、烤和/或高压 处理。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤： (1)将食品蛋白以蒸、煮、烤或高压处理等方式加工后，采用等电点沉淀法、缓冲盐提取 法或有机溶剂提取法从加工后的食物样品中提取蛋白； ⑵将步骤(1)中提取的蛋白与含有胃蛋白酶的体外模拟胃液混合，使胃蛋白酶与食品 蛋白的质量比是1:50; (3) 消化反应在37 °C条件下震荡进行，分别在消化反应0、5、15、30、60、90和120分钟，进 行SDS-PAGE电泳分析； (4) 根据步骤(3)的结果，确定电泳结果的耐酶解条带的数量，由此筛选出获得低致敏 食品的最佳加工方式。
【文档编号】G01N1/34GK105973969SQ201610288600
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】祁艳霞, 赵前程, 李智博, 李伟, 李萌, 高庆历, 于洋, 宋杨
【申请人】大连海洋大学, 祁艳霞