一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条及其制备方法，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC底板，特点是在PVC底板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，该结合垫上包被有所述的抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体一胶体金标记物，该硝酸纤维素膜上分别包被有三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原构成的检测线和兔抗鸡卵黄抗体构成的质控线，优点是灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速、准确性高。
【专利说明】
一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及免疫化学检测技术，尤其是涉及一种基于卵黄抗体的胶体金免疫层析 技术用以快速检测动物各种组织及血液中三疣梭子蟹呼肠孤病毒的检测试纸及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 三疣梭子蟹是我国大型多年生食用蟹类，广泛分布于我国、朝鲜与日本海域。三疣 梭子蟹具有较高的食用与药用价值，其生长快、经济价值高，现已成为继对虾之后的主要海 水养殖对象，是我国沿海水产养殖的主导产品。随着三疣梭子蟹养殖产业的快速发展，养殖 规模不断扩大，养殖密度不断提高，病害日益严重，并成为制约其健康发展的重要因素。
[0003] 近年来，本课题组对三疣梭子蟹大量死亡疫病进行了流行病学、病理学、病原生物 学研究后，发现呼肠孤病毒大量存在于发病梭子蟹各组织中。经回归感染试验表明呼肠孤 病毒（Swimming Crab Reovirus，SCRV)可引起梭子蟹90-100%的死亡率，是其主要爆发病 原，弧菌等可加剧病情。经调查，呼肠孤病毒广泛存在于梭子蟹养殖地区，一经感染几乎全 池覆没，引起的疫病常规药物治疗无效，给养殖产业带来了巨大的经济损失。因此，在苗种 购买、引进和发病初期进行检测，确定病情，以便及时采取措施控制传染和情况恶化，对减 少养殖场损失具有重要意义。
[0004] 目前，病原体的检测方法主要有分离培养、电镜观察、PCR、ELISA、色谱分析等，这 些方法多耗时耗力，需要专用场地和仪器设备，需要专业人员操作。研究人员已成功建立了 ELISA检测梭子蟹呼肠孤病毒（SCRV)的技术，但是整个检测过程至少需要数小时，且对操 作者要求较高，需要酶标仪这样的专业设备。
[0005] 胶体金免疫层析试验（gold-immunochromatography assay GICA)是 20 世纪 80 年代开始发展起来的新的免疫分析方式，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，基 于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低 等优点。依据胶体金免疫层析技术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方面，都已 经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测各种病原和有毒有害物质的试纸条。但是，目前 国内外还没有公开任何关于三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条及其制备方法的相关研究 报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于胶体金免疫层析技术的特异性强、灵 敏度高、检测速度快、成本低并且操作简便的三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条及其制备 方法，满足了现场快速检测的需求。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测 试纸条，所述的试纸条由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素 膜及吸水垫；所述的结合垫上包被有抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物，所述 的硝酸纤维素膜上分别设置有由梭子蟹呼肠孤病毒抗原包被的检测线和由兔抗鸡卵黄抗 体（IgY)包被的质控线。
[0008] 所述的抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：将抗三疣 梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体与胶体金颗粒直径为20-30nm的胶体金溶液按7-9i! g : lmL 混合，在pH5. 4的条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加含10wt%的牛血清白蛋白的 PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分稳定的胶体金 颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未结合的抗梭子蟹呼肠孤病毒 卵黄抗体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标 记物。
[0009] 一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0010] ⑴样品垫的制备
[0011] 将玻璃纤维纸浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖、lwt%吐 温-20的0. 01M pH7. 4的PBS缓冲液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到样品垫，真 空封装，4 °C保存备用；
[0012] (2)特定包被的结合垫的制备
[0013] 将玻璃纤维纸浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖，lwt%吐 温-20的0. 01M pH7. 4的PBS缓冲液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纤维纸上均匀喷涂10-20 y L的抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物，真空 冷冻干燥l_2h，即得到结合垫，真空封装，4°C保存备用；
[0014] (3)特定包被的硝酸纤维素膜的制备
[0015] 将三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成检测线，将 兔抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成质控线，即得到特定包被的硝酸纤 维膜，真空冷冻干燥1-1. 5h，真空封装，4°C保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所述 的检测线靠近结合垫端，所述的质控线靠近吸水垫端；
[0016] (4)试纸条的制备
[0017] 将步骤⑴得到的样品垫、步骤⑵得到的特定包被的结合垫、步骤（3)得到的特 定包被的硝酸纤维膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成4-6mm宽的细条，即得三疣 梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条，真空封装，4°C保存。
[0018] 所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原的制备方法如下：取攻毒感染死亡的梭子蟹， 冰上解剖取其内脏，称量，按1 : 5-1 : 20加入预先冰浴过的含有ImM苯甲基磺酰氟（PMSF) 的TNE2缓冲溶液中匀浆，将匀浆液于4°C，8000g离心20min，沉淀用含ImM PMSF的TNE2缓 冲液重新悬浮匀浆后再次于4°C，8000g离心20min，合并两次离心所得上清液，将上清液于 4°C，6000g离心10min后，取上清液于4°C，38000g离心1. 5h，用预冷的TM2缓冲液洗去沉淀 上层疏松部分，取下层结实白色沉淀部分用含ImM PMSF的预冷的TM2缓冲液重悬后于4°C， 3500g离心5min后，取上清液于4°C，38000g离心1. 5h，用TM2缓冲液洗去上层疏松部分， 下层结实的白色沉淀部分再次用含ImM PMSF的预冷的TM2缓冲液重悬后于4°C，3500g离 心5min后，取上清液再次于4°C，38000g离心1. 5h，用TM2缓冲液洗去上层疏松部分，最终 得到的下层结实的白色沉淀即为三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原。
[0019] 所述的抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：
[0020] (1)抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体的制备
[0021] 取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原和弗氏完全 佐剂等体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免 疫，每只母鸡免疫剂量为500-800 ii g/mL，15-20天后，将梭子蟹呼肠孤病毒抗原和弗氏不 完全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫，每只母鸡免疫剂量 为400-600 ii g/mL，加强免疫重复进行三次，每次间隔时间为7-10天，然后收集鸡蛋测定效 价，当卵黄抗体效价> 1 : 20000时收集鸡蛋，分离卵黄，用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗 体；
[0022] (2)胶体金标记抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体
[0023] 将抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体与胶体金颗粒直径为20_30nm的胶体金溶 液按7 _9 ii g : lmL混合，在pH5. 4的条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加含10wt% 的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未 充分稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未结合的抗 梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒卵 黄抗体 -胶体金标记物，用含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、lwt%海藻糖，0. 02wt%叠 氮化钠的PH7. 4的0. 01M PBS重悬至所述胶体金溶液体积的1/10-1/20作为其工作浓度。
[0024] 用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体的具体方法如下：称取适量步骤（1)分离得到 的卵黄，按质量比1 : 9加入pH5. 0的0. 05M的乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌均匀后4°C静置 过夜，8000g离心20min，取上清液加入饱和硫酸铵至饱和度为40%，4°C搅拌6h，lOOOOg离 心20min，沉淀用10-20倍卵黄质量的双蒸馏水重悬，加入饱和硫酸钠至饱和度为40 %，4°C 搅拌过夜，l〇〇〇〇g离心20min，沉淀用少量pH7. 4的0. 01M的PBS缓冲液重悬后，在PBS缓 冲液中透析即得到抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体。
[0025] 步骤（2)中胶体金制备方法如下：将100mL 0.0 lwt%的氯金酸溶液，加热煮沸后， 边搅拌边加入l_2mL lwt%柠檬酸三钠迅速摇匀，继续加热，溶液由淡黄色变黑变酒红色， 至颜色稳定后继续加热5-10min，冷却后补足失水至100mL，无菌密封，4°C避光保存。
[0026] 所述的检测线距离所述的结合垫6-8mm ;所述的质控线距离所述的吸水垫6-8mm， 所述的检测线和所述的质控线的宽度分别为〇. 8-lmm，两条线相距为5mm。
[0027] 所述的TNE2缓冲液配制方法如下：Tris 6. 0578g、NaCl 23. 4g、乙二胺四乙酸二钠 1. 8612g，补足双蒸水至1L，调节pH至8. 5,高压灭菌；
[0028] 所述的 TM2 缓冲液配制方法如下：Tris 6.0578g、MgCl2.6H20 2.0338g、NaCl 15g， 补足双蒸水至1L，调节pH至7. 4,高压灭菌；
[0029] 所述的 PBST 缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP04. 12H20 2.9g、 KH2P040 . 2g，500 i! L吐温-20,补足双蒸水至1L，调节pH至7. 4,高压灭菌；
[0030] 所述的 PBS 缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP04. 12H20 2.9g、 KH2P040 . 2g，补足双蒸水至1L，调节pH至7. 4,高压灭菌；
[0031] 所述的乙酸-乙酸钠缓冲液配方如下：乙酸钠2. 604g、冰乙酸1. 095g，补足双蒸水 至1L，调pH至5. 0,高压灭菌。
[0032] 所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原的包被量为2-4 ii L/cm ;所述的兔抗鸡卵黄抗 体的包被量为1-2 U L/cm，所述的梭子蟹呼肠孤病毒抗原中含有浓度为ImM的苯甲基磺酰 氟和5wt%的海藻糖作为蛋白酶抑制剂和抗原保护剂。
[0033] 本发明选用三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原作为检测线，抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒特 异性卵黄抗体作为胶体金标记的抗体，利用竞争法来检测待测样品中是否含有梭子蟹呼肠 孤病毒。通过待检样品中的梭子蟹呼肠孤病毒与包被于硝酸纤维膜上的三疣梭子蟹呼肠 孤病毒抗原共同竞争结合抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体_胶体金标记物。若待检样品中 梭子蟹呼肠孤病毒的量高于试纸条的检测限，抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记 物与样品中三疣梭子蟹呼肠孤病毒全部结合，从而不与固定在硝酸纤维膜上的病毒结合而 不出现红色条带而显阳性；若待检样品中不含梭子蟹呼肠孤病毒或其量低于试纸条的检测 限，抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物不能与样品中梭子蟹呼肠孤病毒全 部结合，这样金标抗体在层析过程中会被固定在硝酸纤维膜上的病毒结合而出现红色条带 而显阴性。因此，若待测样品试纸条的检测线和质控线同时出现红色条带，则判断为阴性样 品；若待测样品试纸条检测线不出现红色条带，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性 样品；若质控线上没有红色条带出现，则该试纸条无效。
[0034] 与现有技术相比，本发明的优点在于
[0035] 1、检测快速：整个检测过程只需5-10分钟，能够满足现场检测的需要。
[0036] 2、检测准确率高、特异性强：本反应与其他病毒没有交叉反应，检测准确性能达到 95%以上，与操作复杂的ELISA水平基本相同。
[0037] 3、携带方便，操作简便：本发明改变了对三疣梭子蟹呼肠孤病毒的检测必须由专 业人员才能进行检测的局限性，使各个梭子蟹养殖场均可即时、即地进行检测。
[0038] 4、本发明的检测试纸条制备工艺简单，成本低廉，不需要任何特殊仪器、设备。
[0039] 5、本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，在4°C可有效保存半年以上。
【附图说明】
[0040] 图1为本发明试纸条的结构示意图，图中1为样品垫，2为结合垫，3为硝酸纤维素 膜，4为吸收垫，5为检测线，6为质控线，7为PVC底板；
[0041] 图2为本发明试纸条的制备工艺流程图。
【具体实施方式】
[0042] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0043] 具体实施例1
[0044] 一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条，如图1所示，该试纸条由PVC底板7和在 PVC底板7上依次搭接的样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3及吸水垫4 ;结合垫2上包被 有抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜3上分别设置有由三疣梭 子蟹呼肠孤病毒抗原包被的检测线5和由兔抗鸡卵黄抗体（IgY)包被的质控线6。
[0045] 上述抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：将抗三疣梭 子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体与胶体金颗粒直径为20-30nm的胶体金溶液按7-9 ii g : lmL混 合，在pH5. 4的条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加含10wt%的牛血清白蛋白的 PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分稳定的胶体金 颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未结合的抗梭子蟹呼肠孤病毒 卵黄抗体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标 记物。
[0046] 具体实施例2
[0047] 快速检测三疣梭子蟹呼肠孤病毒胶体金试纸条的制备方法，如图2所示，其具体 操作步骤如下：
[0048] (1)三疣梭子蟹呼肠孤病毒的纯化
[0049] 取攻毒感染死亡的梭子蟹，冰上解剖取其内脏，称量后按体积比1 : 5-1 : 20加 入预先冰浴过的含有ImM苯甲基磺酰氟（PMSF)的TNE2缓冲溶液匀浆，将匀浆液于4°C， 8000g离心20min，沉淀用含ImM PMSF的TNE2缓冲液重新悬浮匀浆后再次于4°C，8000g离心 20min，合并两次离心所得上清液，将上清液于4°C，6000g离心10min后，取上清液于4°C， 38000g离心1. 5h，用预冷TM2缓冲液洗去沉淀上层疏松部分，取下层结实白色沉淀部分用 含ImM PMSF的预冷的TM2缓冲液重悬后于4°C，3500g离心5min后，取上清液再次于4°C， 38000g离心1. 5h，用TM2缓冲液洗去上层疏松部分，下层结实的白色沉淀部分再次用含ImM PMSF的预冷的TM 2缓冲液重悬后于4°C，3500g离心5min后，取上清液再次于4°C，38000g 离心1. 5h，用TM2缓冲液洗去上层疏松部分，最终得到的下层结实的白色沉淀用TM2缓冲液 洗去上层疏松部分，下层结实的白色沉淀即为三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原。
[0050] (2)抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体的制备
[0051] 取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原和弗氏完全 佐剂等体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免 疫，每只母鸡免疫剂量为500-800 i! g/mL，15-20天后，将梭子蟹呼肠孤病毒抗原和弗氏不 完全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫，每只母鸡免疫剂量 为400-600 ii g/mL,加强免疫重复进行三次，每次间隔时间为7-10天，进行三次免疫后收 集鸡蛋测定效价，当卵黄抗体效价> 1 : 20000时收集鸡蛋，分离卵黄，用饱和硫酸铵沉淀 法纯化卵黄抗体。卵黄抗体的纯化的具体方法如下：称取适量卵黄，按质量比1 : 9加入 pH5. 0的0. 05M乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌均匀后4°C静置过夜，8000g离心20min，取上清 液加入饱和硫酸铵至饱和度为40%，4°C搅拌6h，lOOOOg离心20min，沉淀用10-20倍卵黄 质量的双蒸馏水重悬，加入饱和硫酸钠至饱和度为40%，4°C搅拌过夜，10000g离心20min， 取沉淀用少量pH7. 4的0. 01M PBS溶液重悬，在PBS溶液中透析即得到抗梭子蟹呼肠孤病 毒卵黄抗体；
[0052] (3)胶体金标记抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体的方法
[0053] 用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金。用新制的去离子水配制100mL 0.0 lwt% 的氯金酸溶液，加热煮沸后，边搅拌边加入l_2mL lwt%柠檬酸三钠溶液后迅速摇匀，继续 加热，溶液由淡黄色变黑变酒红色，至颜色稳定后继续加热5-10min，冷却后补足失水至 100mL，无菌密封，4°C避光保存；
[0054] 将抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体与胶体金颗粒直径为20-30nm的胶体金溶液按 7_9iig : lmL混合，在pH5. 4的条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加含10wt%的牛 血清蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分 稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未结合的卵黄抗 体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物， 用含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、lwt%海藻糖，0. 02wt%叠氮化钠的pH7. 4的0. 01M PBS重悬至所述胶体金溶液体积的1/10-1/20作为其工作浓度。
[0055] (4)结合垫的包被
[0056] 将玻璃纤维纸浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖，lwt%吐 温-20的pH7. 4的0. 01M PBS缓冲液中30min后，37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻璃 纤维纸上均匀喷涂10-20 y L抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物，真空冷冻干燥 1-2h，即得到结合垫，真空封装，4°C保存备用；
[0057] (5)样品垫的处理
[0058] 将玻璃纤维纸浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖、lwt%吐 温-20的pH7. 4的0. 01M PBS缓冲液中30min后取出，37°C干燥2-3h即得到样品垫，真空 封装，4 °C保存备用；
[0059] (6)硝酸纤维素膜的包被
[0060] 将三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成检测线， 包被量为2-4 y L/cm ;将兔抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成质控 线，包被量为1-2 P L/cm，即得到特定包被的硝酸纤维素膜，真空冷冻干燥1-1. 5h，真空封 装，4°C保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所述的检测线靠近结合垫端，所述的质控 线靠近吸水垫端；三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原中含有浓度为ImM的苯甲基磺酰氟（蛋白酶 抑制剂）和5wt %的海藻糖（抗原保护剂）。
[0061] (7)试纸条组装
[0062] 将样品垫（1)、结合垫（2)、硝酸纤维膜（3)、吸水垫⑷按图2所示的顺序依次粘 附在PVC底板（7)上，PVC底板作为支撑载体，由下及上是由玻璃纤维纸组成的样品吸收 区，然后是吸附了胶体金所标记的卵黄抗体的玻璃纤维层，其次是硝酸纤维素膜，最上一层 是吸水层，由滤纸组成，外面用胶带封住，成为手持部分。各层之间均有1. 5_左右的重叠 交叉。将试纸条切成4-6_宽的小条，真空封装，4°C保存。
[0063] 其中步骤（1)中采用的TNE2缓冲液配制方法是：Tris 6. 0578g、NaCl 23. 4g、乙 二胺四乙酸二钠1. 8612g，补足双蒸水至1L，调节pH至8. 5,高压灭菌；TM2缓冲液配制方法 是：作18 6.05788、]\%(：12*61120 2.03388、恥(：1158，补足双蒸水至比，调节口11至7.4，高压 灭菌。
[0064] 步骤（2)中的乙酸-乙酸钠缓冲液配方如下：乙酸钠2. 604g、冰乙酸1. 095g，补足 双蒸水至1L，调pH至5. 0,高压灭菌。
[0065] 步骤（3)中采用的PBST缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KC1 0. 2g、 Na2HP04 ? 12H202. 9g、KH2P040 . 2g，500 ii L 吐温-20,补足双蒸水至 1L，调节 pH 至 7. 4,高压灭 菌。
[0066] 步骤⑵（3) (4)、（5)中采用PBS缓冲液配制方法是：NaCl 8g、KC1 0. 2g、 Na2HP04 ? 12H20 2. 9g、KH2P040 . 2g补足双蒸水至1L，调节pH至7. 4,高压灭菌。
[0067] 具体实施例3
[0068] 胶体金试纸条对临床样品的检测，具体步骤如下：
[0069] 从当地各超市和各养殖场购买三疣梭子蟹，同时在某暴发疾病大量死亡梭子蟹养 殖场采集梭子蟹样品。取梭子蟹的组织样品，将tne2缓冲液滴加于组织样上，破碎组织， 2000-3000rpm离心5min后取上清液，将检测试纸条插入待检样品中，10分钟后观察结果： 若只在检测试纸条的质控区出现一条红线者为阳性结果，即样品中带有梭子蟹呼肠孤病 毒；若试纸条的检测线和质控线同时出现红线者为阴性结果，即样品中不含有梭子蟹呼肠 孤病毒。每个样品做5次重复，所有临床样品检测结果用酶联免疫吸附法（ELISA)进行比 较。
[0070] 检测结果见表1，我们可以看到在收集的40份三疣梭子蟹样品中，只有在发病养 殖场的梭子蟹样品中出现了阳性结果，8只样品中有7只为阳性结果。对于其余各大超市 及养殖场收集的梭子蟹样品均为阴性结果。所有检测样品只有一份样品结果与ELISA结 果冲突，其余均与ELISA结果相同，说明两者具有高度一致性，胶体金试纸条的准确率高达 97. 5% ;另一方面，胶体金试纸条操作方便快速，5-10分钟即可得到结果，不需要专业人员 和专业设备；综上所述，这种研发的三疣梭子蟹呼肠孤病毒胶体金试纸条是可行的，我们可 以通过胶体金试纸条对发病梭子蟹进行检测确定病因，从而对症下药，及时防治，防止病情 扩大，减少养殖户损失，同时也可以作为在苗种引进时的一种初步筛选工具，这种胶体金试 纸条方便实用，非常适合现场检测。
[0071] 表1梭子蟹呼肠孤病毒试纸条检测临床样品结果
[0073] + :试纸条只出现质控线一条红线，为阳性结果；
[0074] _ :试纸条出现两条红线，为阴性结果。
[0075] 具体实施例4
[0076] 胶体金试纸条的灵敏度检测，具体步骤如下：
[0077] 按具体实施例2中步骤（1)的方法，纯化三疣梭子蟹呼肠孤病毒，用少量的PBS 缓冲液的进行重悬稀释，用超微量核酸/蛋白测定仪（Nanodrop 2000)测定其蛋白浓度。 用PBS缓冲液将其进行一系列的梯度稀释，分别稀释为15 ii g/mL，30 ii g/mL，40 ii g/mL， 50 ii g/mL，75 ii g/mL，100 ii g/mL。吸取三疣梭子蟹呼肠孤病毒液（100 ii L)滴加于检测试纸 条的样品垫上，静置10分钟后观察结果。以检测线消失的最低检测浓度为其最低检测极 限。每种浓度做5次重复。
[0078] 检测结果见表2,我们可以看出在三疣梭子蟹呼肠孤病毒浓度为15 yg/mL， 30 y g/mL，40 y g/mL时试纸条上均出现两条线，检测结果为阴性，而当梭子蟹呼肠孤病毒浓 度为50 ii g/mL，75 ii g/mL，100 ii g/mL时，检测线消失，只有质控线出现一条红色条带，检测 结果为阳性。因此，梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条的检测极限为50y g/mL。
[0079] 表2三疣梭子蟹呼肠孤病毒试纸条灵敏度检测结果
[0081] + :试纸条只出现质控线一条红线，为阳性结果；
[0082] _ :试纸条出现两条红线，为阴性结果。
[0083] 具体实施例5
[0084] 三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条的特异性检测，其具体步骤如下：
[0085] 将对虾白斑综合症病毒（WSSV)、甲鱼系统性败血症球状病毒（STSSSV)和三疣梭 子蟹呼肠孤病毒（SCRV)分别稀释至100 yg/mL，用制备的试纸条分别检测这三种病毒，每 种病毒做5个重复，10分钟后观察结果。若试纸条只在质控线出现一条红色条带，则检测结 果为阳性，若试纸条的检测区和质控区都分别出现一条红色条带，则检测结果为阴性。
[0086] 检测结果见表3,我们可以看出用试纸条检测对虾白斑综合症（WSSV)和甲鱼系统 性败血症球状病毒（STSSSV)时，在试纸条的检测线和质控线分别都出现了一条红色条带， 即检测结果为阴性；而用试纸条检测三疣梭子蟹呼肠孤病毒（SCRV)时只在试纸条的质控 区出现了一条红色条带，检测结果为阳性。由此可见，这种梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条具 有良好的特异性，它不与对虾白斑综合症（WSSV)和甲鱼系统性败血症球状病毒（STSSSV) 发生交叉反应。
[0087] 表3三疣梭子蟹呼肠孤病毒试纸条特异性检测结果
[0089] 当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的 普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条，其特征在于：所述的试纸条由PVC底板和 在PVC底板上依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述的结合垫上包被有 抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上分别设置有由三疣 梭子蟹呼肠孤病毒抗原包被的检测线和由兔抗鸡卵黄抗体（IgY)包被的质控线。2. 根据权利要求1所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条，其特征在于所述的 抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：将抗梭子蟹呼肠孤病毒卵 黄抗体与胶体金颗粒直径为20-30nm的胶体金溶液按7-9 μ g : ImL混合后，在pH5. 4的条件 下通过搅拌振荡30-60min，加含IOwt %的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低 速离心2000-3500rpm，10_20min，再高速离心12000-15000rpm，1-1. 5h，取离心管底部暗红 色沉淀即得到抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物。3. -种根据权利要求1所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条的制备方法，其特征 在于包括以下步骤： (1) 样品垫的制备 将玻璃纤维纸浸泡于含Iwt %牛血清白蛋白、2. 5wt %蔗糖、Iwt %海藻糖、Iwt %吐 温-20的pH 7. 4的0.0 lM PBS缓冲液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到样品垫，真 空封装，4 °C保存备用； (2) 特定包被的结合垫的制备 将玻璃纤维纸浸泡于含Iwt %牛血清白蛋白、2. 5wt %蔗糖、Iwt %海藻糖，Iwt %吐 温-20的pH7. 4的0.0 lM PBS缓冲液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纤维纸上均匀喷涂10-20 μ L的抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物，真空冷冻 干燥1-2h，即得到结合垫，真空封装，4°C保存备用； (3) 特定包被的硝酸纤维素膜的制备 将三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成检测线，将兔 抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成质控线，即得到特定包被的硝酸纤 维素膜，真空冷冻干燥1-1. 5h，真空封装，4°C保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所 述的检测线靠近结合垫端，所述的质控线靠近吸水垫端； (4) 试纸条的制备 将步骤（1)得到的样品垫、步骤（2)得到的特定包被的结合垫、步骤（3)得到的特定包 被的硝酸纤维膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成4-6mm宽的细条，即得三疣梭子 蟹呼肠孤病毒检测试纸条，真空封装，4°C保存。4. 根据权利要求3所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条的制备方法，其特征 在于所述的梭子蟹呼肠孤病毒抗原的制备方法如下：取攻毒感染死亡的梭子蟹，冰上解剖 取其内脏，称量，按1 : 5-1 : 20加入预先冰浴过的含有ImM苯甲基磺酰氟（PMSF)的TNE2 缓冲溶液匀浆，将匀浆液于4°C，8000g离心20min，沉淀用含ImM PMSF的TNE2缓冲液重新悬 浮匀浆后再次于4°C，SOOOg离心20min，合并两次离心所得上清液，将上清液于4°C，6000g 离心10min后，取上清液于4°C，38000g离心I. 5h，用预冷TM2缓冲液洗去沉淀上层疏松部 分，取下层结实白色沉淀部分用含ImM PMSF的预冷的TM2缓冲液重悬后于4°C，3500g离心 5min后，取上清液再次于4°C，38000g离心I. 5h，用TM2缓冲液洗去上层疏松部分，下层结 实的白色沉淀再次用含ImM PMSF的预冷的TM2缓冲液重悬后于4°C，3500g离心5min后， 取上清液再次于4°C，38000g离心I. 5h，用TM2缓冲液洗去上层疏松部分，最终得到的下层 结实的白色沉淀即为梭子蟹呼肠孤病毒抗原。5. 根据权利要求4所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条的制备方法，其特征 在于所述的抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下： (1) 抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体的制备 取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将梭子蟹呼肠孤病毒抗原和弗氏完全佐剂等 体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免疫，每 只母鸡免疫剂量为500-800 μ g/mL，15-20天后，将梭子蟹呼肠孤病毒抗原和弗氏不完全 佐剂进行等体积混合，充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫，每只母鸡免疫剂量为 400-600 μ g/mL，加强免疫重复进行三次，每次间隔时间为7-10天，然后收集鸡蛋测定效 价，当卵黄抗体效价> 1 : 20000时收集鸡蛋，分离卵黄，用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗 体； (2) 胶体金标记抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体 将抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体与胶体金颗粒直径为20-30nm的胶体金溶液按 7-9 μ g :lmL混合，在pH 5. 4的条件下通过搅拌振荡30-60min，加含IOwt %的牛血清 白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min，再高速离心 12000-15000rpm，I -1. 5h，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗 体-胶体金标记物，用含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、Iwt%海藻糖，0. 02wt%叠氮化 钠的pH 7. 4的0.0 lM PBS缓冲液重悬至所述胶体金溶液体积的1/10-1/20作为其工作浓 度。6. 根据权利要求5所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条的制备方法，其特征 在于用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体的具体方法如下：称取适量步骤（1)分离得到的卵 黄，按体积比1 : 9加入pH 5. 0的0. 05M的乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌均匀后4°C静置过 夜，8000g离心20min，取上清液加入饱和硫酸铵至饱和度为40%，4°C搅拌6h，1000 Og离心 20min，沉淀用10-20倍卵黄质量的双蒸馏水重悬，加入饱和硫酸钠至饱和度为40%，4°C搅 拌过夜，1000 Og离心20min，沉淀用少量pH7. 4的0.0 lM的PBS缓冲液重悬后，在PBS缓冲 液中透析即得到抗梭子蟹呼肠孤病毒卵黄抗体。7. 根据权利要求5所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条的制备方法，其特征 在于步骤（2)中胶体金制备方法如下：将IOOmL O.Olwt%的氯金酸溶液，加热煮沸后，边搅 拌边加入l_2mL lwt%柠檬酸三钠迅速摇匀，继续加热，溶液由淡黄色变黑变红色，至颜色 稳定后继续加热5-10min，冷却后补足失水至IOOmL，无菌密封，4°C避光保存。8. 根据权利要求5所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条的制备方法，其特征 在于：所述的检测线距离所述的结合垫6-8mm ;所述的质控线距离所述的吸水垫6-8mm，所 述的检测线和所述的质控线的宽度分别为0. 8-lmm，两条线相距为5mm。9. 根据权利要求5所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条的制备方法，其特征 在于： 所述的TNE2缓冲液配制方法如下：Tris 6. 0578g、NaCl 23. 4g、乙二胺四乙酸二钠 I. 8612g，补足双蒸水至1L，调节pH至8. 5,高压灭菌； 所述的TM2缓冲液配制方法如下：Tris 6.0578g、MgCl2*6H20 2.0338g、NaCl 15g，补足 双蒸水至1L，调节pH至7. 4,高压灭菌； 所述的 PBST 缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0· 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、 KH2PO4O. 2g，500ul吐温-20,补足双蒸水至1L，调节pH至7. 4,高压灭菌； 所述的 PBS 缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、 KH2PO4O. 2g，补足双蒸水至1L，调节pH至7. 4,高压灭菌； 所述的乙酸-乙酸钠缓冲液配方如下：乙酸钠2. 604g、冰乙酸I. 095g，补足双蒸水至 1L，调pH至5. 0,高压灭菌。10.根据权利要求3所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条的制备方法，其特 征在于：所述的梭子蟹呼肠孤病毒抗原的包被量为2-4 μ L/cm ;所述的兔抗鸡卵黄抗体的 包被量为1-2 μ L/cm，所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原中含有浓度为ImM的苯甲基磺酰 氟和5wt%的海藻糖。
【文档编号】G01N33/569GK105891469SQ201410657337
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月14日
【发明人】章礼平, 李登峰, 刘联国, 刘飞, 吴寒华, 顾叶华
【申请人】宁波大学