地乌药材hplc-uv特征图谱构建方法

地乌药材hplc-uv特征图谱构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种地乌药材高效液相色谱(HPLC)特征图谱建立方法，属于中药分析检测领域，以解决地乌药材质量控制的问题。所述方法包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)色谱条件的建立；(4)特征图谱的构建。本发明具有操作简单、精确可靠、重复性好等优点，可较全面检测地乌药材中多种主要有效成分，从而构建地乌药材HPLC?UV特征图谱。
【专利说明】
地乌药材HPLC-UV特征图谱构建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及中药质量控制领域，特别是涉及中药地乌特征图谱的构建方法。
【背景技术】
[0002] 中药质量控制是指采用必要的分析方法和检测手段监控中药的质量，以保证中药 用药的安全性、有效性、稳定性和可控性。由于中药材种类繁多，化学成分复杂，导致中药质 量控制的发展水平一直无法满足现代中药产业的发展。现行的中药质量控制模式多借鉴国 外化学药品质量控制模式建立，只针对某一个或几个成分进行含量测定，这不能很好地反 映中药的复杂性和整体性。因此，提升中药的质量标准，加强质量控制，才能保证中药用药 安全，实现中药的"安全、有效、稳定、可控"（徐翔等，上海中医药杂志，2006，40(3): 50-51)。
[0003] 中药指纹图谱系指中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析方法得到的 能够体现中药材或中药制剂整体特性的图谱，并结合数理统计方法，通过相似度评价中药 材及其制剂质量的优劣，能较全面反映中药中所含化学成分的种类和数量，从而反映出中 药内在质量。中药指纹图谱越来越多的应用于中草药的鉴别和质量控制，世界卫生组织 (WH0)、美国食品药品管理局(FDA)、英国草药典、德国药用植物学会等均接受指纹图谱的质 量控制方法，表明指纹图谱已成为国际公认的控制中药及天然药物质量的有效方法（易伦 朝等，色谱，2008,26(2): 166-171)。
[0004] 2010版《中国药典》首次建立了HPLC"指纹/特征图谱"方法，以控制部分中药品种 的质量，2010版《中国药典》收载HPLC指纹图谱共13项，如三七总皂苷、莪术油和积血草总苷 等，收载HPLC特征图谱共7项，包括人参总皂苷、茵陈提取物和满山红油等。2015版《中国药 典》中，收载HPLC指纹图谱共22项，在2010版《中国药典》基础上添加血脂康片、抗宫炎片、清 开灵注射液等，收载HPLC特征图谱共38项，在2010版《中国药典》基础上添加羌活、沉香、抗 病毒口服液、银黄片等。指纹图谱的应用，可有效控制中药质量，促进中药现代化。但不同产 地、不同采收季节、不同制药企业药材加工工艺等导致同一种中药采用同一个"指纹图谱" 控制，难度较大。因此，采用"特征图谱"方法控制中药质量，只对主要共有特征峰的相对保 留时间做出规定，忽略峰面积较小的峰，更符合中药的特点，也是中药质量控制发展的主要 方向。
[0005] 地乌为毛茛科银莲花属植物林荫银莲花Anemone flaccida Fr.Schmidt的干燥根 茎，又名黑地雷、金串珠、蜈蚣三七等，其性温，味辛、微苦，主产于湖北和贵州，此外，四川、 浙江、湖南等地均有分布(南京中医药大学，中药大辞典(第二版），2005:1115)，具解毒、祛 风湿之功效，临床用于治疗风湿痹痛、跌打损伤等症，在民间广泛用于风湿性和类风湿性关 节炎的治疗。
[0006]植物化学及药理学研究表明，齐墩果烷型三萜皂苷是地乌的主要活性成分(韩林 涛等，中药材，2009，32(7): 1059-1062)，具有抗炎、抗过敏、抗组织胺和免疫调节等作用(邴 飞虹等，中国药科大学学报，2008，39(6): 496-499)。以地乌总皂苷为原料制成的中药五类 新药"地乌风湿安胶囊"（邴飞虹等，湖北中医杂志，2005,27(1):48-49)，具有良好的抗类风 湿性关节炎作用，目前正在进行m期临床研究，具有广阔的开发应用前景。
[0007] 目前，对地乌的质量标准研究主要集中在应用紫外-可见分光光度(uv-Vis)法测 定总皂苷含量(王爱民，中国药房，2007,18(21): 1654-1655)和应用高效液相色谱(HPLC)法 测定地乌中单个化合物含量(赵慧男等，中药材，2013,36(10): 1632-1634)，而未对地乌中 的特征性化学成分进行研究，缺乏对地乌药材的整体质量评价。

【发明内容】

[0008] 基于此，本发明的目的在于构建一种地乌药材HPLC-UV特征图谱的方法，为地乌药 材的整体质量评价提供有效方法，进一步为地乌风湿安胶囊的质量保证提供物质基础。
[0009] 本发明涉及的地乌药材HPLC-UV特征图谱的构建方法，采用的具体技术方案如下：
[0010] (1)对照品溶液的制备
[0011] 精密称取减压干燥至恒重的anhuienoside E、glycoside St_14a、 hemsgiganoside B、flaccidosideII、hederasaponin B对照品适量，加30%乙臆制成浓度 为0.2~0.5mg ? mL-1的混合对照品溶液，滤过，即得。
[0012] (2)供试品溶液的制备
[0013]取地乌药材样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50~100%甲 醇，称重，超声提取，放冷，补足减失的重量，摇匀，用〇.22mi滤膜滤过，取续滤液，即得。 [0014] (3)HPLC-UV色谱条件的建立
[0015] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱;流动相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液(30: 70); 检测波长:200~220nm;流速:0 ? 8~1 ? 2mL ? min-1;柱温:20~50 °C ;进样量:2~20此。
[0016] (4)特征图谱的构建
[0017] 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，记录色 谱图，采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)"软件对所得色谱图进行处理，得 到地乌药材的对照特征图谱，采用计算相对保留时间的方法确定共有峰的辨认。
[0018] 步骤(3)中所应用的高效液相色谱仪为Agilent 1260或Ultimate 3000,色谱柱为 卩]16110111611611^1111&(]18柱，规格为4.61]1111\25〇1]1111，5_，或(]〇811108；[15(]18-]\ /[3-11柱，规格为 4.6mmX250mm，5ym，或U11imate XB-Cis柱，规格为4? 6mmX250mm，5ym。
[0019]上述地乌药材HPLC-UV特征图谱构建方法所得到的特征图谱中有5个特征共有峰， 其中以4号峰f laccidoside II为参照物峰，峰1为anhuienoside E，相对保留时间0.46;峰2 为glycoside St_14a，相对保留时间0.53;峰3为hemsgiganoside B，相对保留时间0.66;峰 4为flaccidosidell，相对保留时间1.00;峰5为hederasaponin B:相对保留时间1.07。各色 谱峰的相对保留时间应在规定值的± 1 〇 %之内。
[0020] 本发明是在对地乌进行系统化学成分研究的基础上，通过HPLC-UV法提供了一种 地乌药材多指标成分的HPLC-UV特征图谱的构建方法。本发明具有操作简单、精确可靠、重 复性好等优点，可较全面检测地乌药材中多种主要有效成分，从而构建特征图谱，为地乌药 材的整体质量评价提供有效方法，进一步为地乌风湿安胶囊的质量保证提供物质基础。
【附图说明】
[0021] 图1为实施例1中地乌主要化学成分的分离流程图；图2为实施例1中的 anhuienoside E的高分辨质谱图；图3为实施例1中的anhuienoside E的核磁共振氢谱图； 图4为实施例1中的anhuienoside E的DEPT图与核磁共振碳谱图；图5为实施例1中的 glycoside St_14a的高分辨质谱图；图6为实施例1中的glycoside St_14a的核磁共振氢谱 图；图7为实施例1中的glycoside St-14a的DEPT图与核磁共振碳谱图；图8为实施例1中的 hemsgiganoside B的高分辨质谱图；图9为实施例1中的hemsgiganoside B的核磁共振氢谱 图；图10为实施例1中的hemsgiganoside B的DEPT图与核磁共振碳谱图；图11为实施例1中 的flaccidoside II的高分辨质谱图；图12为实施例1中的f laccidosidell的核磁共振氢谱 图；图13为实施例1中的flaccidosidell的DEPT图与核磁共振碳谱图；图14为实施例1中的 hederasaponin B的高分辨质谱图；图15为实施例1中的hederasaponin B的核磁共振氢谱 图；图16为实施例1中的hederasaponin B的DEPT图与核磁共振碳谱图；图17为实施例2中的 供试品与对照品溶液色谱峰叠加图；图18为实施例2中的供试品溶液(A)与混标溶液(B)镜 像图及各色谱峰的紫外光谱图；图19为实施例2中的供试品溶液(A)与混标溶液(B)镜像图 及各色谱峰所对应的结构式；图20为实施例2中的地乌药材供试品溶液的总离子流图；图21 为实施例2中的17批不同产地地乌药材特征图谱匹配图；图22为实施例2中的地乌药材HPLC 对照特征图谱；
【具体实施方式】
[0022]以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步阐述。
[0023] 供试样品来源：17批地乌(Anemone flaccida Fr.Schmidt)药材均采自湖北省长 阳县，海拔位于1500~1800米，见表1。
[0024] 表1 17批地乌药材来源
[0027]仪器:Bruker AV-400型核磁共振波谱仪;Agilent 6210ESI/T0F质谱仪;Agilent 1260分析型高效液相色谱仪(G1311C四元栗，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G1314F紫 外检测器，Agilent色谱工作站）；Agilent 6210LC/MSD T0F质谱仪；电子分析天平(感量： 0. lmg;0.01mg,德国Sartorius公司）；KQ-3000E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公 司，功率300W，频率40KHz);Dire Ct-Q5型超纯水机(美国Millipore公司）；微孔滤膜(天津市 津腾实验设备有限公司）。
[0028] 试剂:色谱纯乙腈(德国Merck公司），色谱纯甲醇(德国Merck公司），水为自制超纯 水，其他试剂均为分析纯。
[0029] 实施例1地乌药材中主要化学成分的制备、纯化和结构鉴定
[0030] 如图1所示，取地乌总皂苷110g，用300mL水溶解后，上样于已处理好的MCI小孔树 脂柱，依次用水、15 %、30 %、50 %、70 %和90 %甲醇洗脱，收集70 %甲醇洗脱部位，减压浓缩 至干，得干浸膏（39.36g)。浸膏用50 %甲醇溶解，上样于0DS柱，60 %~95 %甲醇梯度洗脱， 其中60%甲醇洗脱部位经56口1^(1611^-20凝胶柱色谱及制备型1^]^分离[&381]1〇8；[15&8-MS- n (20mm X 250mm，5M1)色谱柱，流动相为30 %乙腈-0.01 %三氟乙酸水溶液，流速为 6.0mL ? min-I，得到化合物2(300mg)和3(200mg)，65%甲醇洗脱部位经制备型HPLC分离 [Cosmosil5Ci8HVIS-n (20mmX250mm，5iim)色谱柱，流动相为32%乙臆，流速为6.0mL ? min 一M，得到化合物1(32011^)。70%甲醇洗脱部位经制备型HPLC分离[Cosmosil 5C18-MS-n (20mm X 250mm, 5_)色谱柱，流动相为45 %乙醇，流速为6 . OmL ? min-M，得到化合物4 (500mg#P5(200mg)。
[0031] 所述制备型HPLC的色谱条件如下：
[0032]色谱柱：Cosmosi 1 5C18-MS- II (20mm X 250mm，5_);柱温：30。(：；检测波长：210nm; 流速:6mL ? min-1;进样量:0.2mL。
[0033]采用波谱学方法鉴定各化合物的结构，各理化数据如下：
[0034] 化合物1 :anhuienoside E，无定形白色粉末，其化学结构如下所示：
[0036] HR-ESI-MS m/z 1233.6274[M-H] -，分子式为C6qH98〇26,高分辨质谱图如图2所示。
[0037] XH NMR(400MHz,pyridine-d5)8H：6.57(lH,br s,H-r),6.25(lH,d,J = 7.4Hz,H-1"，），5.86(lH，br s，H-l""，），5.43(lH，br s，H-12)，5.01(lH，d，J = 7.2Hz，H-l""），4.96 (lH，d，J = 7.0Hz，H-l，），3.37(lH，dd，J=11.5,3.6Hz，H-3)，1.27(3H，s，H3-23)，1.26(3H， s，H3-27)，1.21(3H，s，H3-24)，1.10(3H，s，H3-26)，0.91(6H，s，H3-29,30)，0.88(3H，s，H 3-25) dnhuienoside E的核磁共振氢谱如图3所示。
[0038] 13C NMR( 100MHz，pyridine_d5)数据见表Saanhuienoside E的核磁共振碳谱如图4 所示。
[0039] 参考文献：YE W C，ZHANG Q W，ZHA0 S X，et al .Four New oleanane Saponin from Anemone anhuiensis[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin,2001,49(5)； 632-634.
[0040] 化合物2:glycoside St_14a，白色无定形粉末，其化学结构如下所示：
[0042] HR-ESI-MS m/z 1101.5488[M-H]-，分子式为C54H86〇23，glycoside St-14a的高分 辨质谱图如图5所示。
[0043] 1HMffi(400MHz，pyridine-d5)SH:6.07(lH，d，J = 7.6Hz，H-l，，），5.69(lH，brs，H-l，，，，），5.25(lH，br s，H-12)，4.93(lH，d，J = 7.8Hz，H-l"，），4.89(lH，d，J = 7.5Hz，H-l，）， 3.27(lH，dd，J=11.3,3.2Hz，H-3)，1.19(3H，s，H3-23)，1.14(3H，s，H3-27)，0.92(3H，s，H 3-26)，0.88(3H，s，H3-24)，0.79(3H，s，H3-29)，0.76(3H，s，H 3-30)，0.73(3H，s，H3-25)。 glycoside St_14a的核磁共振氢谱如图6所示。
[0044] 13C NMR(100MHz，pyridine-d5)数据见表Saglycoside St_14a的核磁共振碳谱如 图7所示。
[0045] 参考文献：韩林涛，黄芳.鹅掌草根茎三萜皂苷类成分研究[J].中药材，2009，32 (7):1059-1062.
[0046] 化合物3:hemsgiganoside B，白色无定形粉末，其化学结构式如下所示：
[0048] -￡51_]\^111/2 955.4901[]\1-11]-，分子式为〇481176〇19，1161118818311081(16 8的高分辨 质谱图如图8所示。
[0049] 1HMffi(400MHz，pyridine-d5)SH:6.20(lH，d，J = 8.1Hz，H-r)，5.36(lH，brs，H-12)，5.02(lH，d，J = 7.7Hz，H-l" '），5.00(lH，d，J = 7.9Hz，H-l'），3.36(lH，dd，J=11.5， 4.0Hz，H-3)，1.28(3H，s，H-23)，1.24(3H，s，H3-27)，1.05(3H，s，H 3-26)，0.97(3H，s，H3-24)， 0 ? 86 (3H，s，H3-29)，0 ? 85 (3H，s，H3-30)，0 ? 82(3H，s H3-25) Aemsgiganoside B的核磁氢谱 数据如图9所示。
[0050] 13C NMR(100MHz，pyridine-d5)数据见表Sahemsgiganoside B的核磁碳谱数据如 图10所示。
[0051]参考文献：CHEN Y，CHIU M H,GU K，et al ? Cucurbitacin and triterpenoid glycosides from Hemsleya giganthy[J].Chinese Chemical Letters，2003，14(5):475-478.
[OO52] 化合物4:flaccidosideII，白色无定形粉末，其化学结构式如下所示：
[0054] HR-ESI-MS m/z 1203.6172[M-H]-，分子式为C59H96〇25，flaccidosideII 的高分辨 质谱图如图11所示。
[0055] 1HMffi(400MHz，pyridine-d5)SH:6.55(lH，brs，H-l，，），6.26(lH，d，J = 8.0Hz，H-1"，），5.88(lH，br s，H-l，，，，，），5.39(lH，br s，H-12)，5.01(lH，d，J = 7.8Hz，H-l，，，，），4.84 (lH，d，J = 7.2Hz，H-l，），3.32(lH，dd，J=11.6,3.7Hz，H-3)，1.26(3H，s，H3-23)，1.25(3H， s,H3-27)a.21(3H,s,H3-26)a.ll(3H,s,H3-24),0.90(9H,s,H3-25,29,30)〇flaccidoside II的核磁氢谱数据如图12所示。
[0056] 13C NMR( 100MHz，pyridine_d5)数据见表2<^laccidoside II 的核磁碳谱数据如图 13所示。
[0057] 参考文献：
[0058] [1]范春林，王英，王贵阳，等.从地乌药材中同时制备WjPW3的方法：中国， 201310488046.8[P],2015-7-1.
[0059] [2]Zhao L,Chen ff M,Fang Q C.Two New Oleanane Saponins from Anemone flaccida[J].Planta Medica,1991,57(6):572-574.
[0060] 化合物5:hederasaponin B，白色无定形粉末，其化学结构式如下所示：
[0062] 151-]\^111/2 1203.6174[]\1-11]-，分子式为〇591196〇25。116(16瓜83口0111118的高分辨 质谱图如图14所示。
[0063] 1HNMR(400MHz，pyridine-d5)SH:6.26(lH，d，J = 8.2Hz，H-l，，，），6.13(lH，brs，H-1"），5.87(lH，br s，H-l，，，，，），5.43(lH，br s，H-12)，5.01(lH，d，J = 8.1Hz，H-l，，，，），4.93 (lH，d，J = 5.1Hz，H-l，），3.26(lH，dd，J=12.0,3.6Hz，H-3)，1.27(3H，s，H3-23)，1.19(3H， s，H3-27)，1?12(3H，s，H3-26)，1.09(3H，s，H3-24)，0?92(9H，s，H 3-25，29，30)。 hederasaponin B核磁共振氢谱图如图15所示。
[0064] 13C NMR( 100MHz，pyridine_d5)数据见表Sahederasaponin B核磁共振碳谱图如图 16所示。
[0065] 参考文献：
[0066] [1]范春林，王英，王贵阳，等.从地乌药材中同时制备WjPW3的方法：中国， 201310488046.8[P],2015-7-1.
[0067] [2]SAN0 K,SANADA S,IDA Y,et al.Studies on the constituents of the bark of Kalopanax pictus Nakai[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1991, 39(4):865-870.
[0068] 表2 化合物 1-5碳谱数据（100MHz，pyridine-d5)

[0071]实施例2地乌药材特征图谱构建方法 [0072] (1)对照品溶液的制备
[0073] 精密称取各对照品适量，加30%乙腈分别制成anhuienoside E(0.25mg ? mL-i)、 glycoside St_14a(0?25mg ? mL-1)、hemsgiganoside B(0?25mg ? mL-1)、flaccidosideII (0.5mg ? mL-Ihederasaponin B(0.25mg ? mL-〇的对照品溶液，滤过，即得。
[0074] 表3对照品纯度
[0076] 注:S为参照物峰
[0077] (2)供试品溶液的制备
[0078] 取地乌药材样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇 50mL，称重，超声提取，放冷，补足减失的重量，摇匀，用0.22M1滤膜滤过，取续滤液，即得。
[0079] (3)HPLC_UV色谱条件的建立
[0080] 将步骤(2)的供试品溶液进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：
[0081 ] Agilent 1260型高效液相色谱仪；色谱柱：Phenomenex Luna Ci8(4.6mmX250mm,5 _);流动相：乙腈-o ? 01 %三氟乙酸溶液(30:70);检测波长:210nm;流速：1 ? OmL ? min-1;柱 温：30°C;进样量：10此。
[0082] (4)采用对照品对色谱峰进行确认
[0083]采用上述色谱条件检测地乌药材供试品溶液和对照品溶液，并采用二极管阵列检 测器(DAD)在190~400nm处进行全波长扫描，记录色谱图，对比供试品溶液和对照品溶液各 色谱峰的保留时间和紫外吸收特征。供试品与对照品溶液主要色谱峰叠加图如图17所示， 供试品溶液(A)与混标溶液(B)镜像图及各色谱峰的紫外光谱图如图18所示。
[0084] 根据对照品和供试品溶液中各主要色谱峰的紫外吸收特征和保留时间，对各色谱 峰进行化学指认，供试品溶液(A)与混标溶液(B)镜像图及各色谱峰所对应的结构式如图19 所示。
[0085] (5)采用HPLC-ESI -MS技术对色谱峰进行确认
[0086]质谱条件:离子源:ESI (负离子模式）；干燥器温度:325°C ;干燥气流速:9L ? mirT1; 毛细管电压:4.0kV;扫描质核比范围：100~1500;自动参比离子:119.0363和1033.9881。 [0087]取地乌药材供试品溶液在上述色谱条件和质谱条件下进行检测，地乌药材供试品 溶液的总离子流图如图20所示。各共有峰的保留时间和分子式如表4所示。
[0088]表4共有峰的保留时间和分子式
[0090] (6)特征图谱的建立
[0091] 采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)"软件对17批地乌药材供试品 溶液色谱峰进行分析，采用中位数法，时间窗〇. 1，以4号峰f laccidoside II为参照物峰，经 多点校正自动匹配后生成地乌药材的HPLC对照特征图谱。17批不同产地地乌药材特征图谱 匹配图如图21所示，共确定5个共有特征峰。地乌药材HPLC对照特征图谱如图22所示。
[0092] 实施例3地乌药材特征图谱的测定方法
[0093] (1)供试品溶液的制备
[0094]取地乌药材样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75 %甲醇 50mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再次称定重量，用75%甲醇补足减失的重量， 摇匀，用0.22mi滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0095] (2)高效液相色谱法测定
[0096] 将步骤(1)的供试品溶液进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：
[0097] Agilent 1260型高效液相色谱仪；色谱柱：Cosmosil 5Ci8-MS-n (4.6mmX250mm,5 Mi);流动相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液（30:70);检测波长:205nm;流速：1. lmL ? min-1;柱 温：35°C;进样量:5yL。
[0098] 采用上述方法检测地乌药材供试品溶液，得到色谱图，其他步骤同实施例2。
[0099] 实施例4地乌药材特征图谱的测定方法
[0100] (1)供试品溶液的制备
[0101 ]取地乌药材样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75 %甲醇 50mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再次称定重量，用75%甲醇补足减失的重量， 摇匀，用0.22mi滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0102] (2)高效液相色谱法测定
[0103] 将步骤(1)的供试品溶液进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：
[0104] Agilent 1260型高效液相色谱仪；色谱柱：Ultimate XB-Ci8(4.6mmX250mm，5iim); 流动相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液(30:70);检测波长:200nm;流速：1.2mL ? min-1;柱温:40 °C;进样量：15此。
[0105] 采用上述方法检测地乌药材供试品溶液，得到色谱图，其他步骤同实施例2。
[0106] 实施例5地乌药材特征图谱的测定方法
[0107] (1)供试品溶液的制备
[0108] 取地乌药材样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇 50mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再次称定重量，用75%甲醇补足减失的重量， 摇匀，用0.22mi滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0109] (2)高效液相色谱法测定
[0110] 将步骤(1)的供试品溶液进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：
[0111] Ultimate 3000型高效液相色谱仪；色谱柱：Phenomenex Luna Ci8(4.6111111X250111111， 5_);流动相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液(30:70);检测波长:215nm;流速:0.8mL ? min-1;柱 温:20°C;进样量:20yL。
[0112] 采用上述方法检测地乌药材供试品溶液，得到色谱图，其他步骤同实施例2。
[0113] 实施例6地乌药材特征图谱的测定方法
[0114] (1)供试品溶液的制备
[0115] 取地乌药材样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇 50mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再次称定重量，用75%甲醇补足减失的重量， 摇匀，用0.22mi滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0116] (2)高效液相色谱法测定
[0117] 将步骤(1)的供试品溶液进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：
[0118] Ultimate 3000型高效液相色谱仪；色谱柱：Cosmosil 5Ci8-MS-n (4.6111111X250111111， 5_);流动相：乙腈-0.01%三氟乙酸溶液(30:70);检测波长:220nm;流速:0.9mL.min-S柱 温:25°C;进样量:20yL。
[0119] 采用上述方法检测地乌药材供试品溶液，得到色谱图，其他步骤同实施例2。
[0120] 实施例7地乌药材特征图谱的测定方法
[0121] (1)供试品溶液的制备
[0122] 取地乌药材样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇 50mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再次称定重量，用75%甲醇补足减失的重量， 摇匀，用0.22mi滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0123] (2)高效液相色谱法测定
[0124] 将步骤(1)的供试品溶液进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：
[0125] Ultimate 3000型高效液相色谱仪；色谱柱：Ultimate XB-Ci8(4.6mmX250mm，5ii m);流动相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液（30: 70);检测波长：210nm;流速：1.2mL ? min-1;柱 温:40°C;进样量:5yL。
[0126]采用上述方法检测地乌药材供试品溶液，得到色谱图，其他步骤同实施例2。
[0127] 实施例8地乌药材特征图谱建立方法的验证
[0128] 1、仪器精密度试验
[0129] 取地乌药材样品S 2，按实施例2中步骤(2)制备供试品溶液，采用实施例2中步骤 (3)的色谱条件进行检测，连续进样6次，记录色谱图。以4号峰(flaccidosidell)为参照物 峰(S)，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表5和表6。
[0130] 表5仪器精密度试验的相对保留时间计算结果(n = 6)
[0132] 注:S为参照物峰
[0133] 表6仪器精密度试验的相对峰面积计算结果(n = 6)
[0135] 注:S为参照物峰
[0136] 结果表明，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间的RSD值小于0.08%，相对峰面 积的RSD值小于0.61%，表明仪器的精密度良好。以第一次进样所得的图谱作为参照，采用 "中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版"软件进行分析，计算进样6次所得特征图谱的 相似度，结果表明，相似度均为1. 〇〇〇，相似度良好，见表7。
[0137] 表7仪器精密度试验的相似度计算结果(n = 6)
[0139] 2、方法重复性试验
[0140] 取地乌药材样品S2,按实施例2中步骤(2)平行配制地乌药材供试品溶液6份，采用 实施例2中步骤(3)的色谱条件进行检测，记录色谱图。以4号峰(flaccidosidell)为参照物 峰(S )，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，见表8和表9。
[0141] 表8重复性试验的相对保留时间计算结果(n = 6)
[0143] 注:S为参照物峰
[0144] 表9重复性试验的相对峰面积计算结果(n = 6)
[0146] 注:S为参照物峰
[0147] 结果表明，各共有峰的相对保留时间的RSD值小于0.11%，相对峰面积的RSD值小 于1.60%，表明方法的重复性良好。以第一次进样所得的图谱作为参照，采用"中药色谱指 纹图谱相似度评价系统2004A版"软件进行分析，计算6份供试品溶液所得特征图谱的相似 度，结果表明，相似度均为1.000,相似度良好，见表10。
[0148] 表10重复性试验的相似度计算结果(n = 6)
[0150] 3、样品稳定性试验
[0151] 取样品S2,按实施例2中步骤(2)的方法配制地乌药材供试品溶液，采用实施例2中 步骤(3)的色谱条件分别于制备后的0、2、4、6、8、12、24、36、48h进行检测，记录色谱图。以4 号峰(flaccidosidell)为参照物峰(S)，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，见表 11和表12。
[0152] 表11稳定性试验的相对保留时间计算结果(n = 9)
[0154] 注:S为参照物峰
[0155] 表12稳定性试验的相对峰面积计算结果(n = 9)
[0157] 注:S为参照物峰
[0158] 结果表明，各共有峰的相对保留时间的RSD值小于0.15%，相对峰面积的RSD值小 于0.36%，表明供试品溶液在48h内稳定性良好。以第Oh进样所得的图谱作为参照，采用"中 药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版"软件进行分析，计算供试品溶液所得特征图谱的 相似度，结果表明，相似度均为1. 〇〇〇，相似度良好，见表13。
[0159] 表13稳定性试验的相似度计算结果(n = 9)
[0161] 实施例9地乌药材特征图谱各色谱峰相对保留时间的确定
[0162] 根据实施例2~实施例7采用不同高效液相色谱仪(Agilent 1260高效液相色谱仪 和Ultimate 3000高效液相色谱仪）和不同色谱柱[Phenomenex Luna Ci8(4.6mmX250mm，5ii m)、Cosmosil 5Ci8-MS_ II (4 ? 6mmX 250mm，5ym)和Ultimate XB_Ci8(4 ? 6mmX 250mm，5_)]所 测定的各色谱峰与参照物峰(flaccidosidell )的相对保留时间值，取平均值作为地乌药材 特征图谱中各特征峰与参照物峰(flaccidosidell)之间的相对保留时间值，如表14所示。
[0163] 表14各色谱峰相对保留时间
[0165] 注:S为参照物峰
[0166] 通过对照品和HPLC-MS技术确认了特征图谱的5个共有峰，以4号峰flaccidoside n为参照物峰(S)，特征峰1~5的相对保留时间分别为0.46(峰1，anhuienoside E)、0.53 (峰2，glycoside St_14a)、0 ? 66(峰3，hemsgiganoside B)、1 ? 00(峰4，flaccidoside II )和 1.07(峰5，116(16抑83口〇11；[1113)，并规定5个共有峰的相对保留时间应在规定值的±10%之 内。
[0167] 实施例10地乌药材特征图谱相似度的考察
[0168] 1、17批地乌药材的测定和HPLC特征图谱的获得
[0169] 17批地乌药材均由广州康和药业有限公司提供，按照实施例2中的步骤(2)制备供 试品溶液，采用实施例2中的步骤(3)的色谱条件对17批地乌药材供试品溶液进行测定，记 录色谱图。
[0170] 2、地乌药材HPLC特征图谱相似度考察
[0171]采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版"软件对17批地乌药材供试品溶 液HPLC色谱图进行分析，计算每批地乌药材HPLC特征图谱的相似度，结果如表15所示。
[0173]由表19可知，17批地乌药材HPLC特征图谱与对照特征图谱的相似度除个别批次 (S4)外，相似度均大于0.94，表明地乌药材HPLC特征图谱的建立方法重复性好，相似度高。
【主权项】
1. 地乌药材HPLC-UV特征图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 对照品溶液的制备 精密称取减压干燥至恒重的anhuienoside E、glycoside St_14a、hemsgiganoside B、 :1^1已(3(^(1〇8丨(16 11、116(16瓜8&口〇11；[1113对照品适量，加30%乙臆制成浓度为0.2~0.511^· mL-1 的混合对照品溶液，滤过，即得； (2) 供试品溶液的制备 取地乌药材样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50~100 %甲醇，称 重，超声提取，放冷，补足减失的重量，摇匀，用〇.22μπι滤膜滤过，取续滤液，即得； (3) HPLC-UV色谱条件的建立 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱； 流动相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液(30:70); 检测波长:200~220nm; 流速:〇 · 8~1 · 2mL · min-1; 柱温：20~50 °C; 进样量：2~20yL; (4) 特征图谱的构建 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱图， 采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版)"软件对所得色谱图进行处理，得到地 乌药材的对照特征图谱，采用计算相对保留时间的方法确定共有峰的辨认。2. 根据权利要求1所述的地乌药材HPLC-UV特征图谱构建方法，其特征在于，步骤(3)所 述色谱柱为Phenomenex Luna Cis柱，规格为4.6mmX250mm，5ym，或Cosmosil 5Ci8-MS-n 柱，规格为4 · 6mm X 250mm，5μηι，或Ultimate XB-Cis柱，规格为4 · 6mm X 250mm，5ym〇3. 根据权利要求1所述的地乌药材HPLC-UV特征图谱构建方法，其特征在于，步骤(4)所 述地乌药材特征图谱中共有5个共有峰，其中，以4号峰flaccidoside Π 为参照物峰，峰1为 anhuienoside E，相对保留时间0.46;峰2为glycoside St_14a，相对保留时间0.53;峰3为 hemsgiganoside B，相对保留时间0.66;峰4为f Iaccidoside Π ，相对保留时间1.00;峰5为 116(16^83口〇11；[1113:相对保留时间1.07;各色谱峰的相对保留时间应在规定值的±10%之 内。
【文档编号】G01N30/88GK105891403SQ201610488312
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】范春林, 王英, 杨伟群, 叶文才, 裴红, 鲁展雨
【申请人】广州康和药业有限公司