一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的效力检验方法

一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的效力检验方法
【专利摘要】本发明提供了一种鸭坦布苏病毒病疫苗的血清学效力检验方法，该方法使用HI抗体阴性鸭，分为10只免疫组和5只对照组，免疫组各皮下或肌肉注射鸭坦布苏病毒病疫苗。其中灭活疫苗以0.5ml或1.0ml/只的剂量免疫2次，首免后2周进行二免，活疫苗以1羽份/只的剂量免疫1次。接种后3～4周，采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。对照鸭HI抗体效价均应<1:5，免疫组应至少有7只鸭的血清HI抗体效价≥1:10，判疫苗效力检验合格。本发明提供的血清学效力检验方法操作方便，结果准确，可广泛应用于基层、疫苗研制和检验单位进行鸭坦布苏病毒病疫苗的效力评价和免疫程序的制定。CCTCC V20112220110202
【专利说明】
一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的效力检验方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种兽用疫苗的效力检验方法，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒病疫苗效 力的检验方法，属兽用生物制品检验技术领域。
【背景技术】
[0002] 鸭坦布苏病毒病为2010年发生的一种新发或突发传染病，其病原为鸭坦布苏病毒 (Duck Tembusu Virus，DTMUV)，在病毒分类上属于黄病毒科的成员。主要临床特征为产蛋 鸭产蛋量突然下降和鸭死淘率显著增加，自然感染和人工感染病例的主要大体病变为卵泡 变形、出血、液化及脾脏体积变化(感染早期脾脏肿大，后期脾脏缩小)和颜色变黑。主要的 组织学病变:脾脏白髓体积缩小，淋巴细胞坏死、流失和网状细胞活化增生。脑组织出现嗜 神经原、管套和胶质细胞增生等病毒性脑炎病变。疫情流行初期，根据主要的病理变化，将 该病暂命名为鸭出血性卵巢炎。随后经过病毒分离鉴定和DNA序列同源性分析结果表明，弓丨 起上述鸭疫情的病毒为一种虫媒黄病毒、Ntaya病毒群中的Tembusu病毒（Cao et al.， 2011;Su et al.，2011;Yan et &1.，2011)。2011年中国畜牧兽医学会首届水禽疫病防控研 讨会将该病名称统一为"鸭坦布苏病毒病"。Tembusu病毒首次于1968-1970年在Sarawak地 区的蚊子体内分离到，曾一度认为家禽可能是病毒的自然宿主（Platt et al.，1975)。 Tembusu病毒分别于1982和1992年在泰国北部地区蚊子体内分离到(Leake et al. ,1986; Pandey et &1.，1999)。2000年，研究人员报道了一种新的名为Sitiawan的黄病毒感染鸡后 能够引起鸡生长发育受阻(Kono et al. ,2000)，Sitiawan病毒与Tembusu病毒核酸的同源 性为92%。中国从鸭体内分离到的Tembusu病毒与Bagaza病毒的核酸高度同源（Tang et al.，2012;Yun et al.，2012)。
[0003] 疫苗是预防传染病最有效和经济的手段之一。在鸭坦布苏病毒病疫苗的研究方 面，北京市农林科学院和瑞普(保定)生物药业有限公司、中国农业科学院上海兽医研究所、 齐鲁动物保健品有限公司、福建省农业科学院畜牧兽医研究所和重庆市农科院畜牧兽医研 究所等分别报道了利用该病暴发期间所分离的毒株制备疫苗的方法。效力检验是疫苗质量 检定的重要部分，效力检验方法和标准是疫苗质量控制的基础。在疫苗的效力检验方法中， 免疫攻毒法存在成本昂贵、方法较繁杂和没有动物饲养条件的单位困难更大等缺点。
[0004] 检测抗体的血清学方法由于不需要对免疫动物进行攻毒，避免了病毒扩散的潜在 风险，克服了需要生物安全相应级别的实验室和攻毒动物舍的不便，符合实验动物福利3R (替代、减少和优化)原则，是疫苗效力评价经常使用的方法。抗体检测方法中，常用中和试 验（Serum Neutralization Test，SNT)、血凝抑制试验（Hemagglutination-Inhibition， HI)和酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)。鸭坦布苏病毒感 染或疫苗免疫鸭后，HI和ELISA抗体效价均明显高于中和抗体效价，测定中和抗体效价的中 和试验不是首选。HI试验和ELISA法具有敏感和简便的优点，相比ELISA法，HI试验在定性的 同时，也可以定量。
[0005]
【申请人】前期申请了 3种效力检验方法，均已授权，专利号分别为：Z L 201210203611.7、ZL 201210202292.8、ZL 201210202429.X，本方法是上述授权专利研究工 作基础上的进一步发明，而且采用已经授权的专利技术验证了本方法可用于疫苗效力检 验。申请的HI抗体效价测定法相对简单、对试验设施要求低、不存在散毒和易推广的优点。 在鸭坦布苏病毒病疫苗的血清学效力检验方法中，目前还未见利用HI抗体效价测定法作为 疫苗效力评价方法的报道。

【发明内容】

[0006] 本发明目的是提供一种鸭坦布苏病毒病疫苗的效力检验方法，用于鸭坦布苏病毒 病疫苗的实验室和临床效力评价。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明一方面，提供一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗效力检验方法，该方法使用HI 抗体阴性鸭分为免疫组和对照组，免疫组各皮下或肌肉注射鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，首 免后2周进行二免，两次免疫的剂量均为0.5ml/只~1.0ml/只，接种后3~4周，每只鸭分别 采血，分离血清，使用HI抗原进行HI抗体效价测定。对照组鸭HI抗体效价均应〈1:5,免疫组 应至少有70%鸭的血清HI抗体效价多1:10,判灭活疫苗效力检验合格。
[0009] 本发明另一方面，提供一种鸭坦布苏病毒病活疫苗效力检验方法，其特征在于，使 用HI抗体阴性鸭分为免疫组和对照组，免疫组各皮下或肌肉注射鸭坦布苏病毒病活疫苗， 活疫苗以1羽份/只的剂量免疫1次，接种后2~3周，每只鸭分别采血，分离血清，使用HI抗原 进行HI抗体效价测定。对照组鸭HI抗体效价均应〈1: 5，免疫组应至少有70%鸭的血清HI抗 体效价多1:10,判灭活疫苗效力检验合格。与灭活疫苗检测相比，在疫苗免疫方法上有所区 别。
[0010] 优选地，所述HI抗体阴性鸭为42~560日龄，更优选为42~250日龄，最优选为42~ 140日龄。
[0011] 优选地，所述HI抗体阴性鸭为HI抗体阴性的肉用鸭、蛋用鸭或SPF鸭。例如，肉用鸭 为樱桃谷鸭或北京鸭，蛋用鸭为蛋用麻鸭。
[0012] 优选地，对于灭活疫苗所述两次免疫的剂量均0.5ml或1.0ml/只。
[0013] 优选地，所述HI抗体阴性鸭，其中免疫组不少于10只，对照组不少于5只。例如优选 其中免疫组为10只，对照组为5只。
[0014]所述用于HI抗体检测的试剂是鸭坦布苏病毒HI抗原，其是利用鸭坦布苏病毒HB株 经去除非特异性血凝抑制物质后纯化和灭活后得到。
[0015] 所述HI抗体效价测定的方法是:测定HI抗原的HA效价，用灭菌的抗原稀释液配制4 个工作单位的抗原，利用抗原专用稀释液将待测样品做连续倍比稀释后，加入4个HA单位抗 原，放入湿盒中，2~8 °C过夜，再加入0.33 %的鹅红血球，轻轻混匀后放入湿盒中置37 °C60 分钟，观察凝集反应，试验设阴、阳性血清对照及红细胞对照，根据凝集反应判定抗体效价。
[0016] 所述HI抗原的制备方法是：1)将鸭胚接种鸭坦布苏病毒后制备鸭胚基础毒种，鸭 胚传代不超过3代;2)将鸭胚基础毒种接种乳鼠，取临床症状明显的鼠脑制备HB株毒种，鼠 脑传代不超过3代;3)将HB株病毒接种2~4日龄乳鼠或C6/36细胞获得病毒液;4)灭活;5)加 入保护剂。
[0017]具体地，HI抗原制备方法：
[0018] 1)将鸭胚接种鸭坦布苏病毒HB株(DTMUV-HB株)后制备鸭胚基础毒种，鸭胚传代不 超过3代:取接种鸭坦布苏病毒后死亡鸭胚的尿囊液和胚体，捣碎，按照W/V=l: 10的比例稀 释，冻融1~2次，5000g离心30分钟，取上清液，分装，1.0ml/支。测定鸡胚半数致死量 (ELD 5Q)，并按照中国兽药典进行无菌检验。将病毒含量不低于lO^ELDso/O.lml，且无菌检 验合格的毒种作为基础毒种，鸭胚传代不超过3代(F1~F3代）。
[0019] 2)将鸭胚基础毒种接种乳鼠，取临床症状明显的鼠脑制备DTMUV-HB毒种，鼠脑传 代不超过3代:利用鸭胚基础毒种，以100ELD5Q/0. lml的剂量经脑接种2~4日龄乳鼠，收获精 神沉郁和震颤等临床症状明显的鼠脑。研磨后按照W/V= 1:10的比例稀释，冻融1次，5000g 离心30分钟，取上清夜，分装，1.0ml/支。测定鸡胚半数致死量(ELD5Q)，并按照中国兽药典进 行无菌检验。将鸡胚半数致死量不低于lO^ELDso/O. lml，且无菌检验合格的毒种作为基础 毒种，鼠脑传代不超过3代(F1~F3代）。
[0020] 3)将HB株病毒接种2~4日龄乳鼠获得病毒液:将病毒接种2~4日龄乳鼠，增殖的 病毒含量应不低于ΙΟ^Ευ^ο/Ο. lml。
[0021] 非特异血凝抑制物(脂类物质）的去除：脑组织融化后，按照W/V为1:4的比例加入 终浓度为无菌8.5%的蔗糖，匀浆。在搅动状态下，将匀浆物逐滴加入丙酮溶液中，抽提2次 (离心去除上清液，收集沉淀冷冻干燥，加入无菌生理盐水溶解冷冻干燥后的沉淀），5000~ 10000g离心30~60分钟，上清液即为不含非特异血凝抑制物的病毒液。
[0022] 4)灭活：向上述病毒液中加入甲醛溶液，灭活2~3天。所述甲醛溶液浓度为37~ 40 %，加入甲醛浓度为0 · 02 %~0 · 2 %。
[0023] 5)加入保护剂:按照V/V为3:1的比例加入明胶冻干保护剂或者甘油，制备成冻干 固态抗原或者液态稳定抗原。
[0024]在本发明方法中：（1)明确了疫苗免疫鸭后诱导产生的HI抗体效价彡1:10就可以 保护；（2)5只非免疫鸭HI抗体效价均〈1: 5，免疫组应至少有7只鸭的血清HI抗体效价多1: 1 〇，说明疫苗效力检验合格。
[0025] 本发明的有益效果：国内外尚未见有利用HI抗体效价测定法进行鸭坦布苏病毒病 疫苗效力检验评价的报道，通过本发明人多年和系统研究，提出了利用HI试验进行疫苗效 力检验的方法、判定标准及疫苗质量合格的标准。解决了利用HI试验进行鸭坦布苏病毒病 疫苗的血清学效力评价方法和判定标准的空白。本发明确定的方法准确、灵敏、简单、成本 低和无需特殊仪器设备，可用于鸭坦布苏病毒病疫苗的实验室和临床效力评价。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0027] 若未特别指明，实施例中所用的生物、化学试剂均为常规市售，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028]本发明所用病毒毒株命名为鸭坦布苏病毒HB株，保藏号为CCTCC V201122;鸭坦布 苏病毒是ssRNA病毒，有囊膜。病毒颗粒大体呈球状直径40~60nm。鸭坦布苏病毒对外界环 境的抵抗力较强。病毒在4°C中存放4周，在-20°C中存放10个月，其感染力均不受影响。病毒 对乙醚、氯仿敏感，大多数去污剂能将它迅速灭活。在37°C条件下，用0.1%福尔马林熏蒸6h 可灭活该病毒。鸭出性卵巢炎病毒不能凝集鸡、鸭、火鸡的红细胞，可以凝集0.33~0.5%的 鹅和鸽红血球。该病毒可在2~4日龄小鼠、9~13日龄鸭胚和6~10日龄鸡胚培养，也可在鸭 胚成纤维细胞、C6/36、BHK21细胞和Vero细胞上培养。本发明所用鸭坦布苏病毒病灭活疫苗 的制备方法已经公开，专利号为:2011104473636，公开号为CN102488893B，实施例中所制备 的疫苗是按此方法制备的疫苗。
[0029] 本发明实施例中的活疫苗制备方法如下：将鸭坦布苏病毒HB株（F4代）用无菌 0.5 %乳汉液作200倍稀释，以0. lml/胚的剂量经尿囊腔途径接种9~10日龄SPF鸡胚，接种 后24小时死亡鸡胚弃去，收获24~120小时死亡鸡胚的尿囊液和胚体。将收获的尿囊液混 合，5000rpm离心10分钟，上清液经0.22μπι滤器除菌，以1.0ml/支的规格定量分装，贴签，置_ 70 °C保存。取其中1支接种硫乙醇酸盐培养基(TG )、酪胨琼脂培养基(GA)和葡萄糖蛋白胨培 养基(GP)进行无菌检验和病毒含量测定，将无菌检验合格且病毒含量不低于10 4'5ELD5Q/lml 的毒种按照同样的方法连续传代。取F10代、？40、？60、？80、？100、？120代病毒，用无菌0.5% 乳汉液作200倍稀释后，以0.5ml/只的剂量经胸部肌肉注射210日龄产蛋樱桃谷鸭10只，并 测定病毒囊膜突起糖蛋白（E)基因的序列，Blast进行序列比对。接种后8~10日，剖检，通过 观察产蛋鸭卵巢的病变评价不同代次病毒的安全性。F80代病毒接种产蛋鸭后，8/10的产蛋 鸭卵巢正常，未见F10代病毒接种后出现的卵泡变形、出血或者液化的病变。结果表明，鸭坦 布苏病毒HB株(F4代)经鸡胚连续传80代后已被致弱，且与F10代E基因的同源性为98%。由 于F100代病毒的安全试验、攻毒保护试验和基因序列同源性结果与F80代相同，考虑活疫苗 在生产中存在回传后毒力可能返强的风险，从安全角度讲，确定F100代病毒作为鸭坦布苏 病毒病活疫苗(HB株)的原始毒种，并将其命名为HB-E1代。确定E1~E5代病毒为疫苗原始毒 种，E6~E10代病毒为基础种毒，E11~E13代病毒为工作种毒。将任一代次的工作种毒接种9 ~10日龄SPF鸡胚，收获24小时后死亡感染鸡胚的尿囊液，经无菌和病毒含量（不低于 10 4'5ELD5Q/0.1ml)检验合格后，加入适宜的耐热保护剂，经冷冻真空干燥制成。对制备的疫 苗进行性状、无菌、支原体、外源病毒、鉴别和安全检验均合格后，采用病毒含量测定法(每 羽份病毒含量不低于l〇 2'5ELD5Q)和免疫鸭HI抗体效价测定法进行效力检验。
[0030] 实施例中所用的北京鸭购自鸭坦布苏病毒HI抗体阴性鸭场(北京金星鸭业中心南 口种鸭场），樱桃谷鸭购自鸭坦布苏病毒HI抗体阴性鸭场(河北保定安新县栗小四种鸭场）， 麻鸭购自鸭坦布苏病毒HI抗体阴性鸭场(北京延庆县四海镇珍珠泉下花楼村），SPF鸭由购 自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心的SPF鸭蛋孵化，SPF鸡隔离器中饲养至 试验所需日龄。
[0031] HI抗体阴性（易感)鸭的检验标准：
[0032] 5只来自未经鸭坦布苏病毒病疫苗免疫或无鸭坦布苏病毒病流行史鸭群的鸭(HI 抗体效价均〈1:5)，每只鸭肌肉注射0.5ml以无菌0.5%水解乳蛋白Hank's液5万倍稀释的检 验用毒株。攻毒后2~3日，采血，分离血清进行病毒分离。病毒分离率应至少4/5阳性，判断 检验用鸭为HI抗体阴性(或易感)鸭。
[0033] 实施例1鸭坦布苏病毒病灭活疫苗血清学效力检验方法的建立
[0034] 利用3批(201201、201202、201203)鸭坦布苏病毒病(冊株)灭活疫苗，分别以0.11、 0.33和1.0ml/只的剂量二次免疫16和42日龄北京鸭。二次免疫后28日采血，测定每只鸭血 清的HI抗体，并以0.5ml/只（含100DID 5Q)的剂量进行攻毒。攻毒后2日采血，分离血清，进行 病毒分离。根据 HI 抗体效价(〈1:5、1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320 和1:640)进行 分组，将每只试验鸭的HI抗体效价和病毒分离结果对应分析，分析每组HI抗体效价与攻毒 保护的相关性，制定疫苗HI抗体效价检验合格的标准。
[0035] 1材料与方法
[0036] 1 · 1 材料
[0037] 1.1.1疫苗批号分别为201201、201202、201203的鸭坦布苏病毒病(HB株)灭活疫 苗，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司制备。
[0038] 1.1.2攻毒用毒株DTMUV-HB株(F4代），由北京市农林科学院畜牧兽医研究所分 离、鉴定和保存，DID5q为107·75/0.5ml。
[0039] 1.1.3鸭88只42日龄和68只16日龄北京鸭，由北京金星鸭业南口种鸭场提供。
[0040] 1.1.4 SPF鸡胚6日龄SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。 [0041] 1.1.5试剂灭菌0.5%乳汉液(pH 7.2)，常规方法制备。
[0042] 1.1.6负压动物舍瑞普（保定）生物药业有限公司提供，实验动物许可证SYXK (Ji)2010-0045〇
[0043] 1.2 方法
[0044] 1.2.1试验设计和饲养从养鸭场固定的一栏鸭中随机挑选70只16日龄和90只42 日龄北京鸭，芯片标记，分别免疫3批鸭坦布苏病毒病灭活疫苗。每只鸭以1.0ml的剂量经胸 部肌肉注射途径免疫，首次免疫后14日，以同样的剂量在对侧胸部肌肉进行二次免疫，每批 疫苗各留10只鸭作为非免疫对照，疫苗免疫情况见表1。二次免疫后28日，158只免疫鸭和未 免疫对照鸭，运输至负压动物舍，采血，测定HI抗体效价，汇总免疫鸭HI抗体效价〈1:5、1: 5、 1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640 的数量，并以 0.5ml/只（含lOODIDso)的剂量经 胸部肌肉注射攻毒。攻毒后2日（48h)采血，分离血清，接种6日龄SPF鸡胚，进行病毒分离。 [0045] 1.2.2病毒分离每只鸭的血清经卵黄囊途径接种5枚6日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。 接种后置37°C条件下继续孵化，24小时死亡鸡胚弃去。采用RT-PCR方法测定24~72小时死 亡鸡胚的DTMUV核酸，将1 /5或以上鸡胚死亡且DTMUV核酸阳性的鸭判为DTMUV病毒分离阳 性。
[0046] 1.2.3 HI抗体效价测定按照HA和HI试验的操作术式进行。
[0047] 1.2.4数据分析将每只试验鸭病毒分离与HI抗体效价结果一一对应分析，比较 不同HI抗体效价与攻毒保护率的相关性，并制定疫苗效力检验的判定标准。
[0048] 2 结果
[0049] 2.1免疫组
[0050] 2.1.1 HI抗体效价〈1:5组攻毒保护率为29.4% (5/17)。
[0051] 2.1.2 HI抗体效价1:5组攻毒保护率为78.6% (11/14)。
[0052] 2.1.3 HI抗体效价1:10组攻毒保护率为88.2% (15/17)。
[0053] 2.1.4 HI抗体效价为1:20组攻毒保护率为94.4% (17/18)。
[0054] 2.1.5 HI抗体效价为1:40组攻毒保护率为92.3% (24/26)。
[0055] 2.1.6 HI抗体效价为1:80组攻毒保护率为100% (31/13)。
[0056] 2.1.7 HI抗体效价为1:160组攻毒保护率为100% (11/11)。
[0057] 2.1.8 HI抗体效价为1:320组攻毒保护率为100% (4/4)。
[0058] 2.2对照组HI抗体效价均〈1:5,发病率100% (20/20)。详细结果见表1。
[0059] 3 讨论
[0060] 3.1 HI抗体效价与攻毒保护率的相关性上述结果表明，随着HI抗体效价的升高， 攻毒保护率明显升高，HI抗体效价与攻毒保护率呈正相关。
[0061 ] 3.2 HI抗体效价与攻毒保护从免疫组鸭的HI抗体效价来看，即使HI抗体效价〈1: 5，也有29.4%的攻毒保护率。HI抗体效价等于1:5，就会有78.6%的鸭获得保护。
[0062] 3.3疫苗效力检验标准与已经批准的"病毒分离和卵巢病变观察法确定的疫苗 相对保护率为66.7 %时，就判定疫苗效力检验合格标准"相比，以10只免疫鸭中，7只鸭抗体 效价等于1:5时就可以判定疫苗效力检验合格。但是本次试验中，有1只对照鸭的HI抗体效 价等于1:5(攻毒发病），这可能与血清溶血后，其中非特异凝集抑制物的去除不彻底有关。 同时考虑疫苗免疫持续期效力和疫苗的标准应提高(就高不就低），而且HI抗体效价等于1: 10时攻毒保护率为88.2%，特规定保护的判定标准以HI抗体效价为不低于1:10。目前，采用 HI抗体效价测定法进行疫苗效力评价的方法中，为更能够体现免疫群体的免疫效力，通常 利用HI抗体效价的几何平均值进行判定。至于"采用HI抗体效价的几何平均值不低于1:10 (或者其他值)还是10只免疫鸭中，应7只不低于1:10中的疫苗效力检验合格判定标准，尚需 要进一步研究确定。
[0063] 4 结论
[0064] 4.1初步规定疫苗血清学效力检验合格的标准为:对照鸭HI抗体效价均应〈1: 5， 免疫组应至少有7只鸭的HI抗体效价多1:10。
[0065]表1疫苗效力检验结果




[0071] 备注：为RT-PCR阳性；"+" 为RT-PCR阴性
[0072] 实施例2鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HI抗体测定法)效力检验用鸭的日龄、免疫剂 量、采样时间（1)
[0073]使用鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(批号201201，北京市农林科学院畜牧兽医研究所 和瑞普(保定）生物药业有限公司研制）免疫60日龄鸭坦布苏病毒HI抗体阴性的麻鸭10只， 0.5ml/只，胸部肌肉注射，同时设5只非免疫对照。首免后2周，按照相同剂量和相同途径进 行二免，采集二次免疫后4周鸭的血清，使用附注的HI抗体检测方法检测免疫鸭血清。5只非 免疫鸭HI抗体效价均小于〈1:5,10只免疫鸭9只HI抗体效价多1:10,疫苗效力检验结果符合 规定。
[0074]实施例3鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HI抗体测定法)效力检验用鸭的日龄、免疫剂 量、采样时间（2)
[0075]使用鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(批号201202,北京市农林科学院畜牧兽医研究所 和瑞普(保定）生物药业有限公司研制）免疫42日龄鸭坦布苏病毒HI抗体阴性的北京鸭10 只，1 .〇ml/只，胸部肌肉注射，同时设5只非免疫对照。首免后2周，按照相同剂量和相同途径 二免，采集二次免疫后4周鸭的血清，使用附注的HI抗体检测方法检测免疫鸭血清。5只非免 疫鸭HI抗体效价均〈1:5，10只免疫鸭8只HI抗体效价多1:10，疫苗效力检验结果符合规定。 [0076]实施例4鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HI抗体测定法)效力检验用鸭的日龄、免疫剂 量、采样时间（3)
[0077]使用鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(批号201303,北京市农林科学院畜牧兽医研究所 和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫150日龄鸭坦布苏病毒HI抗体阴性的樱桃谷鸭 10只，1.0ml/只，胸部肌肉注射，同时设5只非免疫对照。首免后2周，按照相同剂量和相同途 径二免，采集二次免疫后4周鸭的血清，使用附注的HI抗体检测方法检测免疫鸭血清。5只非 免疫鸭HI抗体效价均〈1: 5,10只免疫鸭9只HI抗体效价多1:10,疫苗效力检验结果符合规 定。
[0078]实施例5鸭坦布苏病毒病活疫苗(HI抗体测定法）效力检验用鸭的日龄、免疫剂 量、采样时间(4)
[0079]使用鸭坦布苏病毒病活疫苗（批号201401，北京市农林科学院畜牧兽医研究所研 制)免疫42日龄鸭坦布苏病毒HI抗体阴性的樱桃谷鸭10只，1羽份/只，胸部肌肉注射。采集 免疫后3周鸭的血清，使用附注的HI抗体检测方法检测免疫鸭血清。5只非免疫鸭HI抗体效 价均〈1:5,10只免疫鸭8只HI抗体效价多1:10,疫苗效力检验结果符合规定。
[0080]实施例6鸭坦布苏病毒病活疫苗(HI抗体测定法）效力检验用鸭的日龄、免疫剂 量、米样时间（5)
[0081 ]使用鸭坦布苏病毒病活疫苗(批号201402,北京市农林科学院畜牧兽医研究所研 制)免疫210日龄鸭坦布苏病毒HI抗体阴性的麻鸭10只，1羽份/只，胸部肌肉注射。采集免疫 后2周鸭的血清，使用附注的HI抗体检测方法检测免疫鸭血清。5只非免疫鸭HI抗体效价均〈 1:5,10只免疫鸭7只HI抗体效价多1:10,疫苗效力检验结果符合规定。
[0082]实施例7鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HI抗体测定法)效力检验用鸭的日龄、免疫剂 量、米样时间（6)
[0083]使用鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(批号201303,北京市农林科学院畜牧兽医研究所） 免疫70日龄鸭坦布苏病毒HI抗体阴性的北京鸭10只，1.0ml/只，胸部肌肉注射。采集免疫后 3周鸭的血清，使用附注的HI抗体检测方法检测免疫鸭血清。5只非免疫鸭HI抗体效价均〈1: 5，10只免疫鸭9只HI抗体效价多1:10，疫苗效力检验结果符合规定。
[0084]实施例8鸭坦布苏病毒病疫苗(HB株)的效力检验
[0085]分别利用编号为 201201、201202、201203、201301、201302 和 201303 的 6 批鸭坦布苏 病毒病(HB株)灭活疫苗以〇.5ml或1.0ml/只的剂量经肌肉或皮下二次免疫不同日龄和品种 鸭，二次免疫后28日采血，测定每只鸭血清的HI抗体，并以0.5ml/只（含100DID 5Q)的剂量进 行攻毒。攻毒后2日采血，分离血清，进行病毒分离。比较和分析6批疫苗是否都能够通过HI 抗体效价测定和病毒分离法的检验。
[0086] 1材料与方法
[0087] 1 · 1 材料
[0088] 1.1.1 疫苗批号分别为 201201、201202、201203、201301、201302和201303的6批 鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HB株），北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药 业有限公司制备。
[0089] 1.1.2鸭坦布苏病毒病HI抗原北京市农林科学院畜牧兽医研究所制备。
[0090] 1.1.3攻毒用毒株DTMUV-HB株(F4代），北京市农林科学院畜牧兽医研究所分离、 鉴定和保存，DID5q 为 107·75/0.5ml。
[0091] 1.1.4鸭不同日龄和品种鸭的具体信息见表1。
[0092] 1.1.5 SPF鸡胚6日龄SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
[0093] 1.1.6试剂灭菌0.5 %水解乳汉液(pH 7.2 )，常规方法制备。
[0094] 1.1.7负压动物舍瑞普（保定）生物药业有限公司提供，实验动物许可证SYXK (Ji)2010-0045〇
[0095] 1.2 方法
[0096] 1.2.1试验设计和饲养各组免疫鸭芯片标记，分别免疫上述6批疫苗中，每个批 号疫苗免疫12只，同时设非免疫对照6只。每只鸭以1.0ml的剂量经胸部肌肉或颈部皮下注 射途径免疫，首次免疫后14日，以同样的剂量和注射部位进行二次免疫。二次免疫后28日， 随机取10只健康免疫鸭和5只未免疫健康对照鸭，运输至负压动物舍。攻毒前采血，测定HI 抗体效价，并以〇.5ml/只（100DID 5Q)的剂量经胸部肌肉注射攻毒。攻毒后2日（48小时)采血， 分离血清，接种6日龄SPF鸡胚，进行病毒分离。试验设计见表2。
[0097] 1.2.2病毒分离每只鸭的血清经卵黄囊途径接种5枚6日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。 接种后置37°C条件下继续孵化，24小时死亡鸡胚弃去。采用RT-PCR方法测定24~72小时死 亡鸡胚的DTMUV核酸，将1 /5或以上鸡胚死亡且DTMUV核酸阳性的鸭判为DTMUV病毒分离阳 性。
[0098] 1.2.3 HI抗体测定按照HA和HI试验的操作术式进行。
[0099] 1.2.4效力判定标准对照鸭HI抗体效价均应〈1:5,免疫组应至少有7只鸭的HI抗 体效价彡1:10。
[0100] 2 结果
[0101] 2.1免疫组
[0102] 2.1.1 201201 批疫苗
[0103] 2.1.1.1免疫组90%(9/10)免疫鸭的HI抗体效价彡1:10,攻毒保护率为100% (10/10)，符合规定。
[0104] 2.1.1.2对照组5只鸭的HI抗体效价均〈1:5,发病率为100% (5/5)。
[0105] 2.1.2 201202批疫苗
[0106] 2.1.2.1免疫组80% (8/10)免疫鸭的HI抗体效价彡1:10,攻毒保护率为90% (9/ 10)，符合规定。
[0107] 2.1.2.2对照组5只鸭的HI抗体效价均〈1:5,发病率为100% (5/5)。
[0108] 2.1.3 201203批疫苗
[0109] 2.1.3.1免疫组90% (9/10)免疫鸭的HI抗体效价彡1:10,攻毒保护率为90% (9/ 10)，符合规定。
[0110] 2.1.3.2对照组5只鸭的HI抗体效价均〈1:5,发病率为100% (5/5)。
[0111] 2.1.4 201301 批疫苗
[0112] 2.1.4.1免疫组88.9% (8/9)免疫鸭的HI抗体效价彡1:10,攻毒保护率为100% (9/9)，符合规定。
[0113] 2.1.4.2对照组5只鸭的HI抗体效价均〈1:5,发病率为100%(5/5)。
[0114] 2.1.5 201302批疫苗
[0115] 2.1.5.1免疫组70% (7/10)免疫鸭的HI抗体效价彡1:10,攻毒保护率为80% (8/ 10)，符合规定。
[0116] 2.1.5.2对照组5只鸭的HI抗体效价均〈1:5,发病率为100%(5/5)。
[0117] 2.1.6 201303批疫苗
[0118] 2.1.6.1免疫组90% (9/10)免疫鸭的HI抗体效价彡1:10,攻毒保护率为90% (9/ 10)，符合规定。
[0119] 2.1.6.2对照组5只鸭的HI抗体效价均〈1:5,发病率为100% (5/5)。
[0120] 详细结果见表2。
[0121] 3讨论6次试验30只不同日龄和品种的非免疫对照鸭HI抗体效价均〈1:5,攻毒试验 中均发病。6批疫苗均达到或超过了疫苗效力检验的血清学和免疫攻毒保护的检验标准。
[0122] 3 结论
[0123] 3.1 6批产品均达到了疫苗质量标准规定的效力检验标准。
[0124] 3.2 HI抗体效价测定法可以替代免疫攻毒法进行疫苗的效力评价。
[0125] 表2试验用鸭和免疫剂量的信息
[0126]
[0127] 表3疫苗效力检验结果
[0128]


[0131]
[0132] 备注："+"表示阳性；表示阴性；"ND"表示未做
[0133] 采用以上类似的方法，使用鸭坦布苏病毒病活疫苗(批号201401,201402北京市农 林科学院畜牧兽医研究所研制)免疫42日龄鸭坦布苏病毒HI抗体阴性的樱桃谷鸭10只，1羽 份/只，胸部肌肉注射。采集免疫后3周鸭的血清，使用附注的HI抗体检测方法检测免疫鸭血 清。并以〇.5ml/只（含100DID 5Q)的剂量进行攻毒。攻毒后2日采血，分离血清，进行病毒分离。 结果，表明批号201401和201402活疫苗攻毒保护率均达到90% (9/10)。
[0134] 实施例9 HI抗原的制备
[0135] 1、制备抗原用原材料：
[0136] 1)敏感（选择2~4日龄封闭群或近交系）乳鼠，经脑内途径、按照25μ1/只（约含 100ELD 5Q)的剂量接种鸭坦布苏病毒，观察至144小时，乳鼠出现精神沉郁和震颤等临床症 状，乳鼠发病率和死亡率应大于90 %。
[0137] 2)鸭坦布苏病毒HB株，保藏号为CCTCC V201122。
[0138] 2、制备方法，包括以下步骤：
[0139] 1)将鸭胚接种鸭坦布苏病毒后制备鸭胚基础毒种，鸭胚传代不超过3代:取接种鸭 坦布苏病毒后死亡鸭胚的尿囊液和胚体，捣碎，按照W/V=l: 10的比例稀释，冻融1~2次(释 放出病毒），5000g离心30分钟，取上清液，分装，1.0ml/支。测定鸡胚半数致死量(ELD 5Q)，并 按照中国兽药典进行无菌检验。将病毒含量不低于lO^ELDso/O. lml，且无菌检验合格的毒 种作为基础毒种，鸭胚传代不超过3代(F1~F3代）。
[0140] 2)将鸭胚基础毒种接种乳鼠，取临床症状明显的鼠脑制备HB株毒种，鼠脑传代不 超过3代:利用鸭胚基础毒种，以100ELD5Q/0. lml的剂量经脑接种2~4日龄乳鼠，收获精神沉 郁和震颤等临床症状明显的鼠脑。研磨后按照W/V = 1:10的比例稀释，冻融1次，5000g离心 30分钟，取上清夜，分装，1.0ml/支。测定鸡胚半数致死量(ELD5Q)，并按照中国兽药典进行无 菌检验。将鸡胚半数致死量不低于10 6，LD5Q/0. lml，且无菌检验合格的毒种作为基础毒种， 鼠脑传代不超过3代(F1~F3代）。
[0141 ] 3)将HB株病毒接种2~4日龄乳鼠获得病毒液:将病毒接种2~4日龄乳鼠，增殖的 病毒含量不低于lO^ELDso/O. lml。非特异血凝抑制物(脂类物质）的去除:脑组织融化后，按 照W/V为1:4比例加入终浓度为无菌8.5%的蔗糖，匀浆。在搅动状态下，将匀浆物逐滴加入 丙酮，抽提2次(离心去除上清液，收集沉淀冷冻干燥，加入无菌生理盐水溶解冷冻干燥后的 沉淀），5000~10000g离心30~60分钟，上清液即为不含非特异血凝抑制物的病毒液。
[0142] 4)灭活：向上述病毒液中加入甲醛溶液，灭活2~3天。所述甲醛溶液浓度为37~ 40 %，加入甲醛浓度为0 · 02 %~0 · 2 %。
[0143] 5)加入保护剂:按照体积比为3:1的比例加入明胶冻干保护剂或者甘油，制备成固 态抗原或者液态稳定抗原。
[0144] 抗原的质量标准：
[0145] 无菌检验:按现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。
[0146] HA效价:按附注1进行，对0.33 %鹅红细胞(实施例10)的HA效价应不低于1:128。
[0147] 特异性检验:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价多1:10)，对鸭 坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9 亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价〈1:5)。
[0148] 作用与用途:用于鸭坦布苏病毒抗体的检测。
[0149] 贮藏:2~8°C保存，有效期为24个月。
[0150] 规格：1ml/瓶。
[0151] 实施例10 HI抗原的制备
[0152] 1、制备抗原用原材料：
[0153] 1)敏感（选择2~4日龄封闭群或近交系）乳鼠，经脑内途径、按照25μ1/只（约含 100ELD 5Q)的剂量接种鸭坦布苏病毒，观察至144小时，乳鼠出现精神沉郁和震颤等临床症 状，乳鼠发病率和死亡率应大于90 %。
[0154] 2)鸭坦布苏病毒HB株，保藏号为CCTCC V201122。
[0155] 2、制备方法，包括以下步骤：
[0156] 鸭坦布苏病毒HB株(F1代)作为毒种，以25μ1/只（含IOOELDm)的剂量脑内接种2~4 日龄KM品种乳鼠。及时取出精神沉郁、震颤等临床症状明显的鼠，置-20°C以下保存。将乳鼠 取出，用碘酊消毒脑部，在无菌条件下除去脑部皮肤和脑壳，取出脑组织，置灭菌容器中。按 照W/V= 1:4的比例加入终浓度为8.5 %无菌的蔗糖溶液，匀浆。在搅动状态下，将匀浆物逐 滴加入匀浆量10~30倍体积的冷丙酮中。500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物用玻璃棒挤 压磨碎，用与上述相同量的冷丙酮悬浮，冰浴1小时，期间用无菌玻璃棒将沉淀物挤压磨碎。 500g离心5min，弃去上清液。将含有少量丙酮的沉淀物收集到无菌试管内，500g离心5min， 弃去上清液，将沉淀物分装在干燥管内，-70 °C冷冻1小时，真空冷冻干燥2~3小时。按照原 匀浆量V/V= 1/1的比例，加入无菌生理盐水，溶解干燥的沉淀物12~24小时。8000g离心1小 时，取上清液加入终浓度为〇. 05 %的甲醛进行灭活。取6日龄SPF鸡胚10枚，经卵黄囊接种上 清液，每胚0.2ml，置36~37°C继续孵育。24小时照胚，在24小时内死亡的鸡胚判为非特异性 死亡，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚。24小时后，每日照胚2次，观察至168小时，鸡胚全部 存活，判为灭活完全。24~168小时死亡胚及时取出，收获胚体，盲传1代，如无鸡胚死亡，判 为灭活完全。按体积比为3:1的比例在检验合格上清液中加入灭菌甘油，混匀后即为液态稳 定抗原。
[0157] 稳定性:抗原2~8°C存放24个月，HA效价仍不低于1:128，HA试验的操作术式见实 施例11。
[0158] 特异性:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清为阳性反应(HI效价多1:10)，对鸭坦布苏 病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳 性血清均为阴性反应(HI效价〈1:5)。HI试验的操作术式见实施例11。
[0159] 敏感性:可检测出疫苗免疫2~3周和野毒感染4~5天后鸭、鹅血清中的HI抗体。
[0160] 实施例11 HI抗体效价测定
[0161] 1.试剂组成
[0162] HI抗原（实施例9)
[0163] 阳性对照血清1ml
[0164] 阴性对照血清1ml
[0165] 说明书 1份
[0166] 2.材料
[0167] 2.1待检血清
[0168] 2.2耗材96孔U型血凝板、Tip头和移液器等
[0169] 3. HA效价测定操作术式
[0170] 采用96孔U型微量板进行试验，反应总体积为100μΙ。按表4用抗原专用稀释液将抗 原2倍系列稀释，然后加入0.33%的鹅红血球（制备方法见附注1)，轻轻混匀后放入湿盒中 置37 °C 60分钟，观察凝集反应。
[0171] 表4HA效价测定操作术式
[0172]
[0173] 结果判定方法:将血凝板倾斜45°角20~30秒。100%的红细胞被病毒所凝集(不流 淌)判为"++++"，以出现"++++"的最高稀释度作为判定终点。
[0174] 4. HI效价测定操作术式
[0175] 4.1 4个HA单位工作抗原液的制备:根据凝集试验的测定结果，用灭菌的抗原专用 稀释液配制4个工作单位的抗原。血凝效价除以8为抗原的预稀释倍数。举例如下:抗原的HA 效价为128,稀释倍数为128/8 = 16,16倍稀释，即lml的抗原液加入到15ml的抗原专用稀释 液里进行稀释。抗原配制完成应重新进行标定。
[0176] 4.2 HI试验的操作方法:应用96孔U型微量板进行试验，血凝试验的反应总体积为 100μΙ，利用抗原专用稀释液将待测样品（待检血清前处理方法见附注2)做连续倍比稀释 后，加入4个ΗΑ单位抗原，放入湿盒中，2~8°C过夜，再加入0.33 %的鹅红血球，轻轻混匀后 放入湿盒中置37°C60分钟，观察凝集反应，试验设阴、阳性血清对照及红细胞对照，具体操 作方法见表5。
[0177] 表5HI试验操作术式
[0178]
[0179] 结果判定方法：以阳性对照血清出现明显的血凝抑制现象开始判定，当对照阴、阳 性血清的HI效价与已知效价相差不超过1个滴度时，试验结果成立。将血凝板倾斜45°角，以 出现4个单位工作抗原的血凝活性大部分被抑制的血清最高稀释度作为判定终点。待检血 清的HI抗体效价多1:10判为阳性。
[0180] 附1:0.33 %鹅红细胞悬液的制备
[0181] 采集2~4只12~24月龄鸭坦布苏病毒抗体阴性鹅的血液，与等量阿氏液混合，然 后用0.01M，pH 7.2~7.6PBS洗涤3次，以1500rpm离心15分钟，将沉积的红细胞用VAD配制成 0.33%红细胞(V/V)悬液，置4~8°C备用。
[0182] 其中，VAD的配置方法如下：
[0183] 1.5M氯化钠溶液:NaCl 87.7g，加蒸馏水至溶解，总量1000ml;
[0184] 0.5M磷酸氢二钠溶液:Na2HP〇4 · 12H20 17.66g，加蒸馏水至溶解，总量100ml;
[0185] 1.0M磷酸二氢钠溶液:NaH2P〇4 · 2H20 156g，加蒸馏水至溶解，总量1000ml;
[0186] 取1.5M氯化钠溶液100ml，0.5M磷酸氢二钠溶液62ml，1.0M磷酸二氢钠溶液160ml， 加蒸馏水至1000ml，配制成VAD溶液。该溶液与等量pH 9. OBABS混合后pH值为6.2。
[0187] 附2、待检血清的制备
[0188] 2.1将待检血清56~60 °C灭活30分钟。
[0189] 2.2 血清 100μ1+400μ1 25% 白陶土。
[0190] 2.3剧烈震荡血清/白陶土混合物，每5min震荡一次，共20±5min。
[0191] 2.4 lOOOg离心，20min。
[0192] 2.5加入100μΙ 10%鹅红细胞。
[0193] 2.6每隔5min轻轻摇动上层清液，使红细胞保持悬浮状态。
[0194] 2.7 800g离心10min。红细胞会沉积于白陶土上层。
[0195] 2.8将上清液移入新管中，此液体视为1:10稀释的待检血清。
[0196] 其中，25%白陶土混悬液(Kaolin Suspension)的配制如下：
[0197] 白陶土 25g
[0198] pH9.0硼酸氯化钠溶液100ml
[0199] 附3:抗原专用稀释液的配置
[0200] 1.5M氯化钠溶液:NaCl 87.7g，加蒸馏水至溶解，总量1000ml;
[0201] 0.5M硼酸溶液:H3B03 30.92g，加蒸馏水并加温至溶解，冷却后调整总量至700ml;
[0202] IN氢氧化钠溶液:Na0H 40.0g，蒸馏水至溶解，总量1000ml;
[0203] pH9.0硼酸氯化钠溶液：1.5M氯化钠溶液80ml，0.5M硼酸溶液100ml，IN氢氧化钠 溶液24ml，加蒸馏水至1000ml;
[0204] 4%牛血清白蛋白溶液：牛血清白蛋白V 4 · 0g，pH9 · 0硼酸氯化钠溶液90ml，用IN氢 氧化钠溶液和PH9.0硼酸氯化钠溶液校正pH至9.0，最终容量为100ml;
[0205] 抗原稀释液:0.1 %牛血清白蛋白硼酸氯化钠溶液(BABS): 4%牛血清白蛋白溶液 2.5ml，pH9.0硼酸氯化钠溶液97.5ml。
[0206]附4:阴、阳性质控血清的制备
[0207] 将50只34日龄SPF鸭随机分成2组(感染组和非感染对照组），每组25只。经口服(首 次)和肌肉注射(二次)接种途径感染鸭坦布苏病毒HB株，感染鸭和非感染对照组鸭均在SPF 鸡隔离器中饲养。二次感染后27日，采集2组试验鸭血，分离血清，过滤，每组血清混合，按总 量0.01%的比例加入硫柳汞，定量分装，获得1批阳性血清和1批阴性血清产品。阳性血清和 阴性血清均无细菌感染，鸭副粘病毒、禽流感H5亚型、鸭病毒性肠炎和鸭肝炎抗体均为阴 性，阳性血清HI抗体效价为1:1280，且能够中和100个ELD 5Q鸭坦布苏病毒(F4代），阴性血清 HI抗体效价〈1:5，不能够中和100个ELD5〇鸭坦布苏病毒(F4代）。
【主权项】
1. 一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗效力检验方法，其特征在于，使用HI抗体阴性鸭，分为 免疫组和对照组，免疫组各皮下或肌肉注射鸭坦布苏病灭活疫苗，首免后2周进行二免，两 次免疫的剂量均为〇.5ml/只~1.0ml/只，接种后3~4周，采血，分离血清，使用HI抗原进行 HI抗体效价测定，对照组鸭HI抗体效价均应〈1:5,免疫组应至少有70%鸭的血清HI抗体效 价多1:10,判灭活疫苗效力检验合格。2. 根据权利要求1所述的灭活疫苗效力检验方法，其特征在于，所述HI抗体阴性鸭为42 ~560日龄。3. 根据权利要求1所述的灭活疫苗效力检验方法，其特征在于，所述HI抗体阴性鸭为HI 抗体阴性的肉用鸭、蛋用鸭或SPF鸭。4. 根据权利要求1所述的灭活疫苗效力检验方法，其特征在于，所述两次免疫的剂量均 为 0.5 或 1.0ml/只。5. 根据权利要求1所述的灭活疫苗效力检验方法，其特征在于，所述HI抗体阴性鸭，其 中免疫组为10只，对照组为5只。6. 根据权利要求1~5任一项所述的灭活疫苗效力检验方法，其特征在于，用于HI抗体 检测的试剂是鸭坦布苏病毒病HI抗原，其是利用鸭坦布苏病毒HB株经去除非特异性血凝抑 制物质后纯化和灭活后得到。7. 根据权利要求1~5任一项所述的灭活疫苗效力检验方法，其特征在于，所述HI抗体 效价测定的方法是:测定HI抗原的HA效价，用灭菌的抗原稀释液配制4个工作单位的抗原， 利用抗原专用稀释液将待测样品做连续倍比稀释后，加入4个HA单位抗原，放入湿盒中，2~ 8 °C过夜，再加入0.33 %的鹅红血球，轻轻混匀后放入湿盒中置37 °C60分钟，观察凝集反应， 试验设阴、阳性血清对照及红细胞对照，根据凝集反应判定抗体效价。8. 根据权利要求7所述的灭活疫苗效力检验方法，其特征在于，所述HI抗原的制备方法 是：1)将鸭胚接种鸭坦布苏病毒后制备鸭胚基础毒种，鸭胚传代不超过3代;2)将鸭胚基础 毒种接种乳鼠取鼠脑制备HB株毒种，鼠脑传代不超过3代;3)将HB株病毒接种2~4日龄乳鼠 或C6/36细胞获得病毒液;4)灭活;5)加入保护剂。9. 一种鸭坦布苏病毒病活疫苗效力检验方法，其特征在于，使用HI抗体阴性鸭分为免 疫组和对照组，免疫组各皮下或肌肉注射鸭坦布苏病毒病活疫苗，活疫苗以1羽份/只的剂 量免疫1次，接种后2~3周，每只鸭分别采血，分离血清，使用HI抗原进行HI抗体效价测定。 对照组鸭HI抗体效价均应〈1:5，免疫组应至少有70 %鸭的血清HI抗体效价多1:10，判活疫 苗效力检验合格。10. 根据权利要求9所述的活疫苗效力检验方法，其特征在于，所述HI抗体阴性鸭为42 ~560日龄。 所述HI抗体阴性鸭为HI抗体阴性的肉用鸭、蛋用鸭或SPF鸭。 所述HI抗体阴性鸭，其中免疫组为10只，对照组为5只。 所述用于HI抗体检测的试剂是鸭坦布苏病毒病HI抗原，其是利用鸭坦布苏病毒HB株经 去除非特异性血凝抑制物质后纯化和灭活后得到。 所述HI抗体效价测定的方法是:测定HI抗原的HA效价，用灭菌的抗原稀释液配制4个工 作单位的抗原，利用抗原专用稀释液将待测样品做连续倍比稀释后，加入4个HA单位抗原， 放入湿盒中，2~8°C过夜，再加入0.33%的鹅红血球，轻轻混匀后放入湿盒中置37°C60分 钟，观察凝集反应，试验设阴、阳性血清对照及红细胞对照，根据凝集反应判定抗体效价。 所述HI抗原的制备方法是：1)将鸭胚接种鸭坦布苏病毒后制备鸭胚基础毒种，鸭胚传 代不超过3代;2)将鸭胚基础毒种接种乳鼠，取临床症状明显的鼠脑制备HB株毒种，鼠脑传 代不超过3代;3)将HB株病毒接种2~4日龄乳鼠或C6/36细胞获得病毒液;4)灭活;5)加入保 护剂。
【文档编号】G01N33/68GK105866424SQ201610169370
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月23日
【发明人】刘月焕, 林健, 王小蕾, 杨志远, 段会娟, 赵际成, 刘立新, 潘洁
【申请人】北京市农林科学院