重组鲎三因子试剂及其检测内毒素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组鲎三因子试剂，其包含如下组分：无内毒素水；无热源Tris缓冲液；吐温?20；荧光底物；重组鲎C因子；重组鲎B因子；重组鲎凝固酶原因子。本发明提供一种重组鲎三因子试剂及其检测内毒素方法，通过利用昆虫杆状病毒表达系统表达出重组鲎三因子(凝固酶原、B和C因子)，用于检测细菌内毒素，此方法排除了G因子旁路干扰，从而有效地避免了葡聚糖产生假阳性的可能性，并且解决了鲎数量有限、鲎试剂各批次不稳定性的缺点，可作为新型内毒素检测试剂。
【专利说明】
重组鲎三因子试剂及其检测内毒素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体的说是涉及一种重组鲎三因子试剂及其检测内毒 素的方法。
【背景技术】
[0002] 内毒素（endotoxin)是革兰氏阴性菌（G-)细胞外壁的主要成分，又称为脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释 放出来，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质， 作用于体温调节中枢引起发热，休克甚至死亡，因而内毒素检测是药厂制药和医疗设备制 造中必须的一道程序。
[0003] 鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate，LAL/TachypleusAmebocyte Lysate，TAL)是 国际上至今为止检测内毒素的金标准，具有简单、快速、灵敏度高等特点。被广泛应用于检 测注射剂与植入性医疗器械中污染的革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以及临床使用的透 析液和血液中的细菌内毒素含量。但是，鲎试剂只能通过收集鲎血淋巴生产，随着生物制 品，医药如:注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医 疗器械(如一次性注射器，植入性生物材料)等生产单位迅速增长，定量内毒素检测试剂的 需求越来越大，使得海洋中鲎的数量逐渐减少。
[0004] 鲎试剂主要成分包括C因子(Factor C，FC)、B因子(Factor B，FB)、G因子、凝固酶 原(Proclotting enzyme)、凝固蛋白原(或显色基质）以及二价阳离子、缓冲盐等。其酶的级 联反应基本原理已被广泛研究，包括两条凝集反应途径:一条是内毒素介导的C因子途径:C 因子(FC)结合内毒素而被激活，然后激活B因子，活化的B因子将凝固酶原（Proclotting enzyme)转化为凝固酶(clotting enzyme)，凝固酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白，凝固蛋 白相互交联脱水而形成凝胶；另一条是由1，3-?Η)_葡聚糖介导的G因子(FG)途径，同样可以 弓丨起相似的凝集反应，如图1(a)所示，产生假阳性结果。
[0005] 综上所述，开发不依靠使用鲎血淋巴的，用于检测内毒素的快捷而可靠的方法变 得越来越重要。
[0006] 目前鲎试剂细菌内毒素检查法按反应原理分可分为凝胶法、浊度法、显色基质法。 杆状病毒表达系统具有高效表达，安全性好，表达产物稳定，后加工修饰等优点，与细菌、酵 母、哺乳动物细胞表达系统并列为公认的基因工程4大表达系统。我们利用该系统在昆虫细 胞中表达鲎凝固酶原、B和C因子，并分析表达产物内毒素检测活性，旨在为开发低成本新型 内毒素检测试剂奠定基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种重组鲎三因子试剂及其检测内毒素的方法，通过利用昆 虫杆状病毒表达系统表达出重组鲎三因子(凝固酶原因子、B因子和C因子），使用三种重组 因子作为其有效活性成分，检测内毒素，内毒素激活重组C因子，活化的重组C因子激活重组 B因子，活化的B因子将凝固酶原转化为凝固酶，凝固酶将荧光底物裂解，产生荧光复合物， 如图1(b)所示，以定量测定荧光复合物来量化细菌内毒素，此方法排除了 G因子旁路干扰， 从而有效地避免了葡聚糖产生假阳性的可能性，并且解决了鲎数量有限、鲎试剂各批次不 稳定性的缺点，可作为新型内毒素检测试剂。相比重组单因子(C因子）内毒素检测方法，本 发明内毒素检测试剂可以产生级联放大反应，使得内毒素检测更加高效和灵敏。
[0008] 为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供一种重组鲎三因子试剂，其包含如 下组分:无内毒素水;无热源Tris缓冲液；吐温-20;荧光底物;重组鲎C因子;重组鲎B因子； 重组鲎凝固酶原因子。
[0009] 优选的是，其包含如下重量份的组分： 无内毒素水 35~45份； 无热源Tris儀冲液 25~35份； 吐温-20 5~15份；
[0010] 荧光底物 8~12份； 重组鲎C因子 5~15份； 重组鲎B因子 6~14份； 重组鲎凝固酶原因子 6~15份。
[0011]优选的是，其包含如下重量份的组分： 无内毒素水 40份；
[0012] 无热源Tris缓冲液 30份； 吐温-20 ]0份； 荧光底物 10份；
[0013] 重组鲎C因子 10份； 重组鲎B因子 10份； 重组鲎凝固酶原因子 10份。
[0014] 优选的是，所述重组鲎C因子、重组鲎B因子以及重组鲎凝固酶原因子通过使用昆 虫杆状病毒表达系统进行表达而获得。
[0015] 优选的是，所述吐温-20的浓度为0 · 5~1 · 2%〇。
[0016] 优选的是，所述荧光底物的浓度为2~4mM。
[0017] 优选的是，所述无热源Tris缓冲液的pH范围为6.5~7.5。
[0018] 优选的是，所述重组鲎C因子、重组鲎B因子以及重组鲎凝固酶原因子具体采用如 下方法获得：
[0019] 步骤1)提取鲎血液中总的RNA，通过反转录与PCR技术对鲎C因子、鲎B因子以及鲎 凝固酶原因子分别进行扩增，分别得到PCR扩增的鲎C因子，PCR扩增的鲎B因子以及PCR扩增 的鲎凝固酶原因子基因片段；
[0020] 步骤2)提供pTA2载体，分别将PCR扩增的鲎C因子，PCR扩增的鲎B因子以及PCR扩增 的鲎凝固酶原因子的基因片段连接到所述PTA2载体上，分别得到第一重组质粒;对所述每 种第一重组质粒依次经过筛选、抽提、鉴定和双酶切，分别得到第一产物；
[0021] 步骤3)提供第一载体，将得到的所述每种第一产物分别连接到所述第一载体上， 得到第二重组质粒；
[0022]步骤4)分别将所述每种第二重组质粒转化感受态细胞DHlOBac，并依次经过筛选、 抽提和鉴定，分别得到bacmid重组杆粒；
[0023] 步骤5)将得到的每种bacmid重组杆粒转染昆虫细胞，采用昆虫细胞培养基培养， 得到重组杆状病毒，将首次得到的重组杆状病毒以Μ0Ι为0.1的病毒感染量感染昆虫细胞， 通过4次感染，分别得到重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子；
[0024] 其中，所述步骤3)中，当所述第一产物为通过双酶切获得的鲎C因子或鲎凝固酶原 因子基因片段，所述第一载体为pFastBacl;当所述第一产物为通过双酶切获得的鲎B因子 基因片段，所述第一载体为pFastBac-Dual;
[0025] 所述步骤5)中，采用的所述昆虫细胞培养基经过超滤处理。
[0026] 本发明的另一个目的是提供一种检测内毒素的方法，包括如下步骤：
[0027] 步骤1)配置至少6个不同浓度的内毒素标准液；
[0028] 步骤2)配置检测内毒素的试剂，并分别与每个所述的内毒素标准液按1:1的体积 混合，得到混合液，将混合液置于96孔板中；
[0029] 步骤3)同时做阴性对照试验组，样品对照试验组，阳性对照试验组；
[0030] 步骤4)设置酶标仪反应温度为37°C，激发波长360nm，发射波长460nm，反应时间为 1小时；
[0031] 步骤5)以荧光强度变化值(RFU)取对数为纵坐标，内毒素标准液浓度取对数做标 准曲线。
[0032]优选的是，在所述步骤3)中阴性对照试验中，其溶液分别经过50KD以及10KD的超 滤柱过滤。
[0033]本发明至少包括以下有益效果：
[0034] (1)本发明通过利用昆虫杆状病毒表达系统构建一种可以在昆虫细胞中高效表达 的鲎因子C、鲎因子B和鲎因子凝固酶原的重组杆粒，然后用每种重组杆粒感染昆虫细胞，经 过扩增表达获得重组鲎因子C、鲎因子B和鲎因子凝固酶原三因子，采用该重组三因子作为 内毒素检测的试剂在检测内毒素时可以产生级联放大反应，使得内毒素检测更加高效和灵 敏，可以在30min内完成检测，其灵敏度可以达到0.005EU/mL;
[0035] (2)本发明的重组鲎三因子可以代替传统的鲎试剂，既解决了海洋动物鲎数量急 剧减少的问题，又避免了传统鲎试剂由于G因子干扰而产生的内毒素检测假阳性，可以作为 一种新型的内毒素检测试剂；
[0036] (3)本发明的重组鲎三因子相对于传统的鲎试剂，内毒素检测试剂的成分单一，可 以使用生物工程技术进行生产和严格的质量控制，从而避免了由原材料引起的批次不稳定 性，同时采用昆虫杆状病毒表达系统表达重组鲎三因子，只需采集少量鲎血细胞而不需要 使用鲎血淋巴生产，保护了海鲎这一古老的"活化石"物种，且可以快速地以低成本生产包 含这些重组鲎三因子的内毒素检测试剂。
[0037] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【附图说明】
[0038] 图1中，（a)为本发明所述的传统鲎试剂内毒素检测原理图；（b)为本发明所述的重 组鲎三因子内毒素检测原理图；
[0039] 图2中，（a)为鲎因子C基因昆虫表达载体的构建示意图；（b)为鲎因子B基因昆虫表 达载体的构建示意图；（c)为鲎因子凝固酶原基因昆虫表达载体的构建示意图；
[0040] 图3中，（a)显微镜下的Sf9细胞示意图；（b)转染鲎因子C重组杆粒的Sf9细胞示意 图；（c)转染鲎因子B重组杆粒的Sf9细胞示意图；（d)转染鲎因子凝固酶原重组杆粒的Sf9细 胞示意图；
[0041] 图4中，（a)阴性对照试验组的溶液经50KD超滤柱处理前后的示意图；（b))阴性对 照试验组的溶液经10KD超滤柱处理前后的示意图；（c)内毒素检测动态荧光曲线，曲线从上 到下依次对应内毒素浓度为1〇、1、〇.5、0.1、0.05、0.01、0.005、(^1]/1111 ;((1)标准曲线。
【具体实施方式】
[0042]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0043]应当理解，本文所使用的诸如"具有"、"包含"以及"包括"术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。
[0044] 在本发明的重组鲎三因子是在分别重组的鲎C因子，鲎B因子，鲎凝固酶原因子，此 外，鲎C因子，鲎B因子，鲎凝固酶原因子在下文中可以分别被称作因子C、因子B、因子凝固酶 原。因子C、因子B、因子凝固酶原可以共同的称为因子。
[0045] 鉴于内毒素检测的重大意义，以及海洋动物鲎数量急剧减少的问题，本发明提供 了一种新型的内毒素检测试剂一一重组鲎三因子试剂，其包含如下组分:无内毒素水;无热 源Tris缓冲液；吐温-20;荧光底物；重组鲎C因子；重组鲎B因子；重组鲎凝固酶原因子。这 里，鲎的例子包括圆尾鲎、美洲鲎、马来鲎或中国鲎的一种，在这些鲎中，上述鲎的三因子优 选中国鲎。
[0046] 作为本发明的一个较优实施方案，所述重组鲎三因子试剂包含如下重量份的组 分： 无内毒素水 35~45份； 无热源Tris缓冲液 25~35份； 吐温-20 5~15份;
[0047] 荧光底物 8~12份； 重组鲎C因子 5~15份； 重组鲎B因子 6~14份； 重组鲎凝固酶原因子 6~15份。
[0048]作为本发明的一个较优实施方案，所述重组鲎三因子试剂包含如下重量份的组 分： 无内毒素水 40份;： 无热源Tris缓冲液 30份； 吐温-20 10份；
[0049] 荧光底物 10份： 重组鲎C因子 10份; 重组鲎B因子 10份； 重组餐凝面酶原因子 10份。
[0050] 作为本发明的一个较优实施方案，所述重组鲎C因子、重组鲎B因子以及重组鲎凝 固酶原因子的每一种通过使用昆虫杆状病毒表达系统进行表达而获得，昆虫杆状病毒表达 系统是一种真核系统，利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白强启动子构件的表达载体，可 使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达，现在表达系统中使用的杆状病毒没有特 别限制，主要该杆状病毒可以感染昆虫细胞，并且由此可以表达因子，并且可以适当地使用 通常用于在昆虫细胞中表达蛋白的杆状病毒，所述杆状病毒优选苜蓿丫纹夜蛾核型多角体 病毒(AcMNPV)，所述昆虫细胞没有特别限制，只要该细胞可以表达所述因子，并且可以适当 地使用通常用于表达异源蛋白的细胞，这样的昆虫细胞的例子包括Sf9、Sf21、SF+和Hing-Five，所述昆虫细胞优选Sf9。
[00511作为本发明的一个较优实施方案，所述吐温-20的浓度为0.5~1.2%。，优选1%0。 [0052]作为本发明的一个较优实施方案，所述荧光底物的浓度为2~4mM。
[0053] 作为本发明的一个较优实施方案，所述无热源Tris缓冲液的pH范围为6.5~7.5。
[0054] 作为本发明的一个较优实施方案，所述重组鲎C因子、重组鲎B因子以及重组鲎凝 固酶原因子采用昆虫杆状病毒表达系统进行表达的方法如下：
[0055] 步骤1)提取鲎血液中总的RNA，通过反转录与PCR技术对鲎C因子、鲎B因子以及鲎 凝固酶原因子分别进行扩增，分别得到PCR扩增的鲎C因子，PCR扩增的鲎B因子以及PCR扩增 的鲎凝固酶原因子基因片段；
[0056]步骤2)提供pTA2载体，分别将PCR扩增的鲎C因子，PCR扩增的鲎B因子以及PCR扩增 的鲎凝固酶原因子的基因片段连接到所述PTA2载体上，分别得到第一重组质粒;对所述每 种第一重组质粒依次经过筛选、抽提、鉴定和双酶切，分别得到第一产物；
[0057]步骤3)提供第一载体，将得到的所述每种第一产物分别连接到所述第一载体上， 得到第二重组质粒；
[0058]步骤4)分别将所述每种第二重组质粒转化感受态细胞DHlOBac，并依次经过筛选、 抽提和鉴定，分别得到bacmid重组杆粒；
[0059] 步骤5)将得到的每种bacmid重组杆粒转染昆虫细胞，采用昆虫细胞培养基培养， 得到重组杆状病毒，将首次得到的重组杆状病毒以Μ0Ι为0.1的病毒感染量感染昆虫细胞， 通过4次感染，分别得到重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子；
[0060] 其中，所述步骤3)中，当所述第一产物为通过双酶切获得的鲎C因子或鲎凝固酶原 因子基因片段，所述第一载体为pFastBacl;当所述第一产物为通过双酶切获得的鲎B因子 基因片段，所述第一载体为pFastBac-Dual;
[0061] 所述步骤5)中，采用的所述昆虫细胞培养基经过超滤处理;经过超滤处理、可以去 除培养基中存在的内毒素，提高试剂的检测灵敏度；
[0062] 所述步骤2)和所述步骤3)中的筛选方法采用蓝白斑筛选;所示步骤2)和步骤4)中 鉴定采用PCR鉴定测序。
[0063] 本发明的另一实施方案，是采用上述试剂进行内毒素检测的方法，包括如下步骤：
[0064] 步骤1)配置至少6个不同浓度的内毒素标准液，优选8个；
[0065] 步骤2)配置检测内毒素的试剂，并分别与每个所述的内毒素标准液按1:1的体积 混合，得到混合液，将混合液置于96孔板中；实验发现，在该比例下，标准曲线的相关系数R 2 >0.98,说明标准曲线图已完美接近于一条直线，由此测得的内毒素含量将更加准确(R2由 软件0rigin8拟合获得）；
[0066] 步骤3)同时做阴性对照试验组，样品对照试验组，阳性对照试验组；
[0067]步骤4)设置酶标仪反应温度为37°C，激发波长360nm，发射波长460nm，反应时间为 1小时；
[0068]步骤5)以荧光强度变化值(RFU)取对数为纵坐标，内毒素标准液浓度取对数做标 准曲线，标准曲线有效性的判定条件为当相关系数R2>0.98;变异系数CV〈10%;阴性反应值 低于最低浓度，标准曲线有效。
[0069]在上述技术方案中，在所述步骤3)中阴性对照试验中，其溶液分别经过50KD以及 10KD的超滤柱过滤。
[0070] 现在将通过实施例更具体的描述本发明。
[0071] 实施例1本发明重组鲎三因子的表达 [0072]步骤1:鲎三因子基因的获得及扩增；
[0073] 提取鲎血细胞中的总RNA，并反转录成cDNA。根据GenBank中鲎C因子、鲎B因子和鲎 凝固酶原因子的编码区序列设计引物，通过PCR扩增三因子基因片段，分别得到扩增后的鲎 C因子、鲎C因子和鲎凝固酶原因子目的基因片段。
[0074]步骤2:重组三因子表达载体的构建及克隆；
[0075]将扩增后的鲎C因子、鲎B因子和鲎凝固酶原因子目的基因片段分别与pTA2VeCt〇r 均在室温（15~25°C)条件下连接30min，得到第一重组质粒，然后将每种第一重组质粒分别 转化DH5a感受态细胞，涂布含有氨苄霉素的平板，37 °C培养过夜，蓝白斑筛选并挑取阳性单 克隆菌落，37 °C液体培养基培养过夜，抽提质粒，进行PCR鉴定并测序，对经测序正确的重组 质粒，进行双酶切，分别得到第一产物；
[0076]将通过双酶切获得的鲎C因子或鲎凝固酶原因子基因片段得到的第一产物与 pFastBac-Dual载体连接，将通过双酶切获得的鲎B因子基因片段第一产物与pFastBacl载 体连接;连接温度均是16°C，连接时间均为24小时，分别得到第二重组质粒，将每种第二重 组质粒转化DH5a感受态细胞，涂布含有氨苄霉素和庆大霉素的平板，37 °C培养过夜，蓝白斑 筛选并挑取阳性单克隆菌落，37°C液体培养基培养过夜，抽提质粒，进行双酶切鉴定并测 序；
[0077]将所述每种第二重组质粒转化DHlOBac感受态细胞，涂布含有庆大霉素、硫酸卡钠 霉素和四环素的平板，37°C培养过夜，蓝白斑筛选并挑取阳性单克隆菌落，37°C液体培养基 培养过夜，抽提质粒，进行PCR鉴定并测序，分别得到bacmid重组杆粒。
[0078]步骤3:重组鲎三因子细胞的表达；
[0079]如图3所示，将每种Bacmid重组杆粒转染Sf 9单层细胞(六孔板），细胞出现明显的 病毒感染症状时，收集培养上清，离心速度1450r/min，时间5min，得到的上清即为P1，取P1 按Μ0Ι值0.1感染Sf9细胞取培养上清得到P2，再感染Sf9细胞，再取培养上清，两次后获得高 滴度的P3病毒，噬菌斑法测病毒滴度；用P3代病毒感染Sf 9细胞，72h后收集培养上清液，分 别得到鲎重组C因子、鲎重组B因子和鲎重组凝固酶原因子;考虑到细胞培养基中存在的内 毒素可能会影响重组鲎因子的内毒素检测灵敏度，我们将实验所用培养基进行超滤处理， 提高试剂的检测灵敏度。
[0080]步骤4:内毒素的检测；
[0081 ] 按照细菌内毒素标准品说明书，将内毒素稀释成0，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1， 10EU/mL；
[0082] 配制内毒素反应试剂:无内毒素水40yL，无热源Tris缓冲液(pH6.8)30yL，吐温-20 (1 %。浓度）1 OyL，荧光底物(3mM) 1 OyL，重组C因子1 OyL，重组B因子1 OyL，重组凝固酶原因子 l〇yL;并分别与每个所述的内毒素标准液按1:1的体积混合，得到混合液，将混合液置于96 孔板中；每孔加入l〇〇yL内毒素反应试剂和100yL内毒素标准品（每个浓度3个复孔），同时做 阴性对照试验组l〇〇yL，其中，阴性对照组的溶液分别经过50KD以及10KD的超滤柱过滤，如 图4(a)(每个浓度3个复孔)和图4(b)(每个浓度2个复孔)所示，样品对照试验组100yL(每个 浓度2个复孔），阳性对照试验组100yL(每个浓度2个复孔）；
[0083]设置酶标仪反应温度为37°C，激发波长360nm，发射波长460nm，反应时间为1小时， 内毒素检测动态荧光曲线，如图4(c)所示；
[0084] 以荧光强度变化值(RFU)取对数为纵坐标，内毒素标准浓度取对数做标准曲线如 图4(d)所示，标准曲线有效性的判定条件为当相关系数R 2>0.98;变异系数CV〈10%;阴性反 应值低于最低浓度，标准曲线有效。
[0085] 实施例2
[0086]重组鲎三因子的表达与实施例1完全相同，不同之处在于内毒素检测中，内毒素反 应试剂的组成不同，内毒素试剂的组分含量为：无内毒素水35yL，无热源Tris缓冲液 (pH6.5)25yL，吐温-20(0.5%。浓度）5以1^，荧光底物（21111)8以1^，重组(：因子5以1^，重组8因子641^， 重组凝固酶原因子6yL，其他均相同。
[0087] 实施例3
[0088]重组鲎三因子的表达与实施例1完全相同，不同之处在于内毒素检测中，内毒素反 应试剂的组成不同，内毒素试剂的组分含量为：无内毒素水40yL，无热源Tris缓冲液 (pH7.5)30yL，吐温-20(1.2%。浓度）1(^1^，荧光底物(4111]\〇1(^1^，重组(：因子1(^1^，重组8因子 1 OyL，重组凝固酶原因子1 OyL，其他均相同。
[0089]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【主权项】
1. 一种重组鲎三因子试剂，其特征在于，其包含如下组分： 无内毒素水;无热源Tri S缓冲液;吐温-20;荧光底物;重组鲎C因子;重组鲎B因子;重组 鲎凝固酶原因子。2. 如权利要求1所述的重组鲎三因子试剂，其特征在于，其包含如下重量份的组分： 无内毒素水 35~45份； 无热源Tris缓冲筂 25~35份； 吐温-20 5~15份； 荧光底物 8~12份； 重组鲎C因子 5~15份； 重组鲎B因子 6~14份； 重组鲎凝固酶原因子 6~15份。3. 如权利要求1述的重组鲎三因子试剂，其特征在于，其包含如下重量份的组分： 无内毒素水 40.份； 无热源Tris缓冲液 30汾； 吐温-20 10份； 荧光底物 10份: 重组鲎C因子 10份; 重组鲎B因子 10份; 重组鲎凝固酶原因子 10份。4. 如权利要求1至3中的任一项所述的重组鲎三因子试剂，其特征在于，所述重组鲎C因 子、重组鲎B因子以及重组鲎凝固酶原因子通过使用昆虫杆状病毒表达系统进行表达而获 得。5. 如权利要求4所述的重组鲎三因子试剂，其特征在于，所述吐温-20的浓度为0.5~ 1.2%〇 〇6. 如权利要求4所述的重组鲎三因子试剂，其特征在于，所述荧光底物的浓度为2~ 4mM〇7. 如权利要求4所述的重组鲎三因子试剂，其特征在于，所述无热源Tris缓冲液的pH范 围为6.5~7.5。8. 如权利要求4所述的重组鲎三因子试剂，其特征在于，所述重组鲎C因子、重组鲎B因 子以及重组鲎凝固酶原因子具体采用如下方法获得： 步骤1)提取鲎血液中总的RNA，通过反转录与PCR技术对鲎C因子、鲎B因子以及鲎凝固 酶原因子分别进行扩增，分别得到PCR扩增的鲎C因子，PCR扩增的鲎B因子以及PCR扩增的鲎 凝固酶原因子基因片段； 步骤2)提供pTA2载体，分别将PCR扩增的鲎C因子，PCR扩增的鲎B因子以及PCR扩增的鲎 凝固酶原因子的基因片段连接到所述PTA2载体上，分别得到第一重组质粒;对所述每种第 一重组质粒依次经过筛选、抽提、鉴定和双酶切，分别得到第一产物； 步骤3)提供第一载体，将得到的所述每种第一产物分别连接到所述第一载体上，得到 第二重组质粒； 步骤4)分别将所述每种第二重组质粒转化感受态细胞DHlOBac，并依次经过筛选、抽提 和鉴定，分别得到bacmid重组杆粒； 步骤5)将得到的每种bacmid重组杆粒转染昆虫细胞，采用昆虫细胞培养基培养，得到 重组杆状病毒，将首次得到的重组杆状病毒以M0I为0.1的病毒感染量感染昆虫细胞，通过4 次感染，分别得到重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子； 其中，所述步骤3)中，当所述第一产物为通过双酶切获得的鲎C因子或鲎凝固酶原因子 基因片段，所述第一载体为pFastBacl;当所述第一产物为通过双酶切获得的鲎B因子基因 片段，所述第一载体为pFastBac-Dual; 所述步骤5)中，采用的所述昆虫细胞培养基经过超滤处理。9. 一种应用如权利要求4~8中的任一项所述的试剂检测内毒素的方法，其特征在于， 包括如下步骤： 步骤1)配置至少6个不同浓度的内毒素标准液； 步骤2)配置检测内毒素的试剂，并分别与每个所述的内毒素标准液按1:1的体积混合， 得到混合液，将混合液置于96孔板中； 步骤3)同时做阴性对照试验组，样品对照试验组，阳性对照试验组； 步骤4)设置酶标仪反应温度为37 °C，激发波长360nm，发射波长460nm，反应时间为1小 时； 步骤5)以荧光强度变化值(RFU)取对数为纵坐标，内毒素标准液浓度取对数做标准曲 线。10. 如权利要求9所述的检测内毒素的方法，其特征在于，在所述步骤3)中阴性对照试 验中，其溶液分别经过50KD以及10KD的超滤柱过滤。
【文档编号】G01N33/579GK105866080SQ201610206584
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】张春, 张轶岭, 祁静, 刘晓玫
【申请人】中国科学院苏州生物医学工程技术研究所