一种筛选α–淀粉酶抑制剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种筛选α-淀粉酶抑制剂的方法，所述方法包括：配制酶促反应缓冲液、底物溶液、α-淀粉酶溶液、显色剂溶液和供试品溶液，备用；将供试品溶液点样于薄层板上，挥去溶剂后或使用适宜的展开剂展开晾干后浸渍于底物溶液中，然后取出、挥干溶剂，再浸渍于α-淀粉酶溶液中，在5～50℃进行酶促反应10～60分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂后浸渍于显色剂溶液中进行显色反应；在可见光下进行检视：出现的白色或黄色或棕色背景下的蓝色斑点即为α-淀粉酶抑制剂。本发明提供了一种可方便、快捷地筛选α-淀粉酶抑制剂的方法，为从天然物质中筛选出具有α-淀粉酶抑制活性成分的研究提供了一条理想途径。
【专利说明】
一种筛选α -淀粉酶抑制剂的方法
技术领域
[0001]本发明是涉及一种筛选α -淀粉酶抑制剂的方法，具体说，是涉及一种利用薄层色谱-生物自显影技术筛选α -淀粉酶抑制剂的方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病是一种因体内胰岛素绝对或相对分泌不足所致的内分泌代谢疾病，具有高致死率、高致残率和高医疗费的特征，是继肿瘤、心脑血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。目前临床降糖药有磺脲类、双胍类、胰岛素增敏药、非磺脲类胰岛素促泌药、葡萄糖苷酶抑制剂等，其中，α -葡萄糖苷酶抑制剂是通过竞争性抑制小肠上皮绒毛膜上的糖苷酶的作用来减少糖类的降解，延缓糖类的消化和吸收，从而有效地降低糖尿病人餐后血糖浓度。
[0003]胰α -淀粉酶是消化系统中的另一个关键酶，属于α -糖苷酶范畴。胰α -淀粉酶是淀粉的第一步水解酶，将淀粉水解成小分子寡糖，包括麦芽糖、麦芽三糖和许多α -(1-6)和α - (1-4)寡糖。这些寡糖在α -葡萄糖苷酶的作用下进一步降解为葡萄糖，吸收入血液循环。因此，胰α -淀粉酶能导致对膳食淀粉的快速降解，从而升高餐后血糖(PPHG) ο
[0004]20世纪70年代，人们开始意识到一些抑制剂能够抑制或部分抑制小肠二糖酶和胰α -淀粉酶的活性，这些抑制剂可以用来口服治疗非胰岛素依赖型(2型糖尿病)糖尿病。因此，α -淀粉酶抑制剂在治疗2型糖尿病方面具有重要意义。目前，临床主要应用的α -淀粉酶抑制剂如阿卡波糖等存在一系列副作用，例如:胃肠胀气、腹痛、腹泻等。相比之下，天然物质来源的α -淀粉酶抑制剂因其作用温和、毒副作用小、来源广泛等优势突显，因此，得到研究者的广泛关注。
[0005]而现有技术采用的体内、体外多种实验筛选方法，对试验化合物的纯度及用量均有较高要求，存在筛选难度大、成本高等缺陷。尤其是，天然物质的有效成分通常不够明确，且活性效果大多由多成分、多靶点的协同作用产生，采用现有技术的筛选方法对来源于天然物质的α -淀粉酶抑制剂进行筛选时，会存在更大困难，不仅耗时费力，而且复杂低效。因此，研究一种可快速筛选α -淀粉酶抑制剂的方法，对筛选来源于天然物质的α -淀粉酶抑制剂将具有重要意义。
【发明内容】
[0006]针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种筛选α -淀粉酶抑制剂的方法，利用薄层色谱-生物自显影技术，实现快速、低成本、高灵敏度和专属性地筛选α -淀粉酶抑制剂。
[0007]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
[0008]—种筛选α -淀粉酶抑制剂的方法，包括如下步骤:
[0009]a)配制酶促反应缓冲液、底物溶液、α -淀粉酶溶液、显色剂溶液和供试品溶液，备用；所述的酶促反应缓冲液选用PH值为6.5?9.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；所述的底物溶液选用PH值为6.0?7.0、含0.05wt%? lwt%可溶性淀粉的磷酸盐缓冲溶液；所述的α -淀粉酶溶液选用含α -淀粉酶的活性浓度多6U/mL的酶促反应缓冲液；所述的显色剂溶液选用碘含量为0.1?20mg/mL的碘-碘化钾水溶液；
[0010]b)将供试品溶液点样于薄层板上，挥去溶剂后备用或使用适宜的展开剂展开后取出、晾干备用；
[0011]c)将经步骤b)处理后的薄层板浸渍于底物溶液中，然后取出、挥干溶剂；
[0012]d)将经步骤c)处理后的薄层板浸渍于α -淀粉酶溶液中，在5?50°C进行酶促反应10?60分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂；
[0013]e)将经步骤d)处理后的薄层板浸渍于显色剂溶液中进行显色反应；
[0014]f)对经步骤e)显色后的薄层板进行检视:在可见光下出现的白色或黄色或棕色背景下的蓝色斑点即为α-淀粉酶抑制剂。
[0015]作为优选方案，所述的酶促反应缓冲液由三羟甲基氨基甲烷与盐酸及氯化钙形成，其中的三轻甲基氨基甲烧的摩尔浓度为25?80mmol/L。
[0016]作为优选方案，所述的磷酸盐缓冲溶液由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠形成，且所形成的磷酸盐的摩尔浓度为15?25mmol/L。
[0017]作为优选方案，所述的显色剂溶液由碘化钾与碘按质量比为3:1形成的碘含量为I?5mg/mL的水溶液。
[0018]作为优选方案，所述的薄层板选用硅胶板、聚酰胺板、纤维素板中的任意一种。
[0019]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果和显著性进步:
[0020]I)无需复杂的仪器和设备，操作简单，实验耗费低，适合一般实验室操作，而且灵敏度和专属性高于常规筛选方法；
[0021]2)筛选结果形象直观，易于辨识和记忆；
[0022]3)筛选过程以薄层板为媒介，不受溶剂和供试品浓度的限制，使得受试样品的选择范围更为广泛；
[0023]总之，本发明提供了一种可方便、快捷地筛选α -淀粉酶抑制剂的方法，为从天然物质中筛选出具有α -淀粉酶抑制活性成分的研究提供了一条理想途径，具有显著性应用价值。
【附图说明】
[0024]图1为实施例1采用本发明的筛选方法对阿卡波糖抑制α-淀粉酶活性能力的检视结果。
[0025]图2为实施例2对所用底物溶液中所含的可溶性淀粉的适宜浓度范围的验证结果；其中:Α板所用的底物溶液中含可溶性淀粉为0.05wt%, B板所用的底物溶液中含可溶性淀粉为Iwt %。
[0026]图3为实施例3对所用显色剂溶液中所含碘的适宜浓度范围的验证结果；其中:A板所用的显色剂溶液中碘含量为0.lmg/mL, B板所用的显色剂溶液中碘含量为20mg/mL。
[0027]图4为实施例4对所用α -淀粉酶溶液中所含α -淀粉酶的适宜活性浓度范围的验证结果；其中:Α板所用的α -淀粉酶溶液中含α -淀粉酶的活性浓度为6U/mL，B板所用的α -淀粉酶溶液中含α -淀粉酶的活性浓度为120U/mL。
[0028]图5为实施例5对酶促反应的适宜温度范围的验证结果；其中:A板所用的酶促反应温度为5°C，B板所用的酶促反应温度为50 °C。
[0029]图6为实施例6对酶促反应的适宜时间范围的验证结果；其中:A板所用的酶促反应时间为10分钟，B板所用的酶促反应时间为60分钟。
[0030]图7为实施例7对紫苏子、女贞子和黄芩提取物在不同检视条件下检视结果对比；其中:A图是在254nm波长光照下的检视结果，B图是在366nm波长光照下的检视结果，C图是在可见光下的检视结果。
[0031]图8为实施例8采用本发明的筛选方法对罗格列酮、米格列醇、齐墩果酸和木犀草素对α -淀粉酶的抑制能力的筛选结果；其中:Α为阿卡波糖；Β为罗格列酮；(:为米格列醇；D为齐墩果酸；E为木犀草素。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步阐述:
[0033]实施例1
[0034]—、溶液配制
[0035]酶促反应缓冲液的配制:将302.5mg三羟甲基氨基甲烷和330mg无水氯化钙溶于水中，用盐酸调节PH值至7.5，然后加水定容至lOOmL，即得pH为7.5、三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为25mmol/L的酶促反应缓冲液，置于2?4°C冰箱中保存备用。
[0036]底物溶液的配制:将312mg NaH2PO4.2H20 和 716mg Na2HPO4.12H20 溶于 10mL 去离子水中，调节PH为6.9，即得pH为6.9、磷酸盐浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液；取Ig可溶性淀粉溶于10mL上述磷酸盐缓冲溶液中，在95°C水浴加热4小时后，放冷，于8000转/分钟下离心10分钟，所得上清液即为pH值为6.9、含lwt%可溶性淀粉的磷酸盐缓冲溶液的底物溶液，置于2?4°C冰箱中保存备用。
[0037]α -淀粉酶溶液的配制:将α -淀粉酶加入上述酶促反应缓冲液中，配制成α -淀粉酶的活性浓度为6U/mL的α -淀粉酶溶液。
[0038]显色剂溶液的配制:将碘化钾和碘按质量比3:1溶于去离子水中，配制成碘含量为2mg/mL的显色剂溶液。
[0039]供试品溶液的配制:将5mg阿卡波糖(Acarbose)粉末溶于10mL甲醇中，配制成浓度为0.05mg/mL的阿卡波糖溶液。
[0040]二、对α -淀粉酶的抑制活性的检视操作
[0041]将上述供试品溶液点样于薄层板上，平行点样3点，点样量均为I μ L ;挥干甲醇溶剂后浸渍于上述底物溶液中；取出、挥干溶剂，再浸渍于上述α-淀粉酶溶液中，于37°C进行酶促反应30分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂，再浸渍于上述显色剂溶液中进行显色反应；在可见光下进行检视，检视结果如图1所示:在薄层板上的所有供试品溶液样点均表现为黄色背景下的蓝色斑点，说明阿卡波糖为α-淀粉酶抑制剂，与现有研究结果一致，进一步说明本发明方法具有可行性。
[0042]实施例2
[0043]本实施例与实施例1的不同之处仅在于:所用的底物溶液分别选用pH值为6.9、含0.05wt%可溶性淀粉的磷酸盐缓冲溶液及pH值为6.9、含1?〖％可溶性淀粉的磷酸盐缓冲溶液，其余溶液均与实施例1中所述相同。
[0044]将供试品溶液分别点样于2个薄层板(简记为:A板和B板)上，每板平行点样3点，点样量均为I yL ;分别挥干甲醇溶剂后浸渍于上述底物溶液中；取出、挥干溶剂，再浸渍于α-淀粉酶溶液中，于37°C进行酶促反应30分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂，再浸渍于显色剂溶液中进行显色反应；在可见光下进行检视，检视结果如图2所示:在A板和B板上的所有供试品溶液样点均表现为黄色背景下的蓝色斑点，说明所用底物溶液中所含的可溶性淀粉的浓度在0.05wt%?Iwt%均适宜。
[0045]实施例3
[0046]本实施例与实施例1的不同之处仅在于:所用的显色剂溶液中的碘含量分别为
0.lmg/mL和20mg/mL，其余溶液均与实施例1中所述相同。
[0047]将供试品溶液分别点样于2个薄层板(简记为:A板和B板)上，每板平行点样3点，点样量均为I yL ;分别挥干甲醇溶剂后浸渍于底物溶液中；取出、挥干溶剂，再浸渍于α -淀粉酶溶液中，于37°C进行酶促反应30分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂，再浸渍于上述显色剂溶液中进行显色反应；在可见光下进行检视，检视结果如图3所示:在A板和B板上的所有供试品溶液样点均出现了白色或黄色或棕色背景下的蓝色斑点，显色剂溶液中的碘含量的高低只是影响薄层板的背景颜色，随着碘含量的增大，背景色由白色到黄色再到棕色改变，但不影响检视结果；说明所用显色剂溶液中所含碘的浓度在0.1?20mg/mL均适宜。
[0048]实施例4
[0049]本实施例与实施例1的不同之处仅在于:所用的α -淀粉酶溶液中所含α -淀粉酶的活性浓度分别为6U/mL和120U/mL，其余溶液均与实施例1中所述相同。
[0050]将供试品溶液分别点样于2个薄层板(简记为:A板和B板)上，每板平行点样3点，点样量均为I yL ;分别挥干甲醇溶剂后浸渍于底物溶液中；取出、挥干溶剂，再浸渍于上述α-淀粉酶溶液中，于37°C进行酶促反应30分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂，再浸渍于显色剂溶液中进行显色反应；在可见光下进行检视，检视结果如图4所示:在A板和B板上的所有供试品溶液样点均出现了黄色背景下的蓝色斑点，说明所用的α -淀粉酶溶液中所含α -淀粉酶的活性浓度只要多6U/mL即可得到较好的检视效果。
[0051]实施例5
[0052]本实施例所用溶液均与实施例1中所述相同。
[0053]将供试品溶液分别点样于2个薄层板(简记为:A板和B板)上，每板平行点样3点，点样量均为I yL ;分别挥干甲醇溶剂后浸渍于底物溶液中；取出、挥干溶剂，再浸渍于α -淀粉酶溶液中，分别于5°C进行酶促反应30分钟(A板)及50°C进行酶促反应30分钟(B板)；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂，再浸渍于显色剂溶液中进行显色反应；在可见光下进行检视，检视结果如图5所示:在A板和B板上的所有供试品溶液样点均出现了黄色背景下的蓝色斑点，说明酶促反应温度在5?50°C均可，以37°C为最佳。
[0054]实施例6
[0055]本实施例所用溶液均与实施例1中所述相同。
[0056]将供试品溶液分别点样于2个薄层板(简记为:A板和B板)上，每板平行点样3点，点样量均为I yL ;分别挥干甲醇溶剂后浸渍于底物溶液中；取出、挥干溶剂，再浸渍于α -淀粉酶溶液中，分别于37°C进行酶促反应10分钟(A板)及37°C进行酶促反应60分钟(B板)；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂，再浸渍于显色剂溶液中进行显色反应；在可见光下进行检视，检视结果如图6所示:在A板和B板上的所有供试品溶液样点均出现了黄色背景下的蓝色斑点，说明酶促反应时间在10?60分钟均可，以30分钟为最佳。
[0057]实施例7
[0058]本实施例所用溶液与实施例1的不同之处仅在于:所用供试品溶液分别由紫苏子、女贞子和黄芩提取物制得:称取紫苏子、女贞子和黄芩药材细粉各0.5g，分别加入5mL甲醇中，超声波处理30分钟后，离心，取上清液，即得紫苏子供试品溶液、女贞子供试品溶液和黄芩供试品溶液。
[0059]分别吸取上述三种供试品溶液各6 μ L，点样于同一薄层板上，挥去甲醇后以氯仿-甲醇-水-甲酸(体积比为9:1:0.1:0.05)为展开剂进行展开，取出薄层板并充分挥干展开剂后浸渍于底物溶液中；取出、挥干溶剂，再浸渍于α-淀粉酶溶液中，于37°C进行酶促反应30分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂，再浸渍于显色剂溶液中进行显色反应；分别在254nm波长光照下进行检视(如图7中的A图)、在366nm波长光照下进行检视(如图7中的B图)及在可见光下进行检视(如图7中的C图)。由不同检视条件下的检视结果可见:在可见光下的检视结果与现有研究结果一致，即:紫苏子、女贞子和黄芩提取物均对α -淀粉酶具有一定抑制活性，且紫苏子的活性大于女贞子，女贞子的活性大于黄芩。
[0060]实施例8
[0061]采用实施例1所述的酶促反应缓冲液、底物溶液、α -淀粉酶溶液及显色剂溶液和筛选方法，分别对罗格列酮、米格列醇、齐墩果酸和木犀草素对α -淀粉酶的抑制活性进行检视:
[0062]对照品溶液:将阿卡波糖(Acarbose，货号:A8980_1G，购自Sigma)溶于甲醇，配制成浓度为0.05mg/mL的溶液；
[0063]罗格列酮供试品溶液:将罗格列酮(Rosiglitazone，货号:111M4728V，购自Sigma)溶于甲醇，配制成浓度为lmg/mL的溶液。
[0064]米格列醇供试品溶液:将米格列醇(Miglitol，货号:0446211_4，购自Caymanchemical)溶于去离子水溶液中，配制成浓度为lmg/mL的溶液。
[0065]齐墩果酸供试品溶液:将齐墩果酸(Oleanolic acid，货号:07_2004，购自上海中药标准化研究中心)溶于甲醇，配制成浓度为lmg/mL的溶液。
[0066]木犀草素供试品溶液:将木犀草素(Luteolin，货号:05-2008，购自上海中药标准化研究中心)溶于甲醇，配制成浓度为lmg/mL的溶液。
[0067]将上述对照品溶液和供试品溶液分别点样于5张薄层板上(依次标记为A、B、C、D、E)，均平行点样3点，对照品点样量为I μ L，供试品点样量为3 μ L，无需展开，挥干溶剂后均浸渍于底物溶液中；取出、挥干溶剂，再浸渍于α-淀粉酶溶液中，于37°C进行酶促反应30分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂，再浸渍于显色剂溶液中进行显色反应；在可见光下进行检视，检视结果如图8所示，图8中:A为阿卡波糖；B为罗格列酮；(:为米格列醇；D为齐墩果酸；E为木犀草素。由图8可见:与阿卡波糖比较，木犀草素和罗格列酮均表现出一定的α -淀粉酶抑制活性，罗格列酮对α -淀粉酶的抑制活性相对较弱，米格列醇和齐墩果酸则对α-淀粉酶不具有抑制活性。
[0068]综上实验可见:本发明方法不需要复杂的仪器和设备，可快速、高通量筛选出对α -淀粉酶具有抑制活性的成分，不仅筛选结果形象直观、易于辨识和记忆，而且灵敏度和专属性高于常规筛选方法，并且不受溶剂和供试品浓度的限制，使得受试供试样品的选择范围更为广泛，适合一般实验室操作，为筛选出具有α -淀粉酶抑制活性成分提供了一种便捷实用的途径，具有显著性应用价值。
[0069]最后有必要在此说明的是:以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制；本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种筛选α -淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤: a)配制酶促反应缓冲液、底物溶液、α-淀粉酶溶液、显色剂溶液和供试品溶液，备用；所述的酶促反应缓冲液选用PH值为6.5?9.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；所述的底物溶液选用PH值为6.0?7.0、含0.05wt%?Iwt %可溶性淀粉的磷酸盐缓冲溶液；所述的α -淀粉酶溶液选用含α -淀粉酶的活性浓度多6U/mL的酶促反应缓冲液；所述的显色剂溶液选用碘含量为0.1?20mg/mL的碘-碘化钾水溶液； b)将供试品溶液点样于薄层板上，挥去溶剂后备用或使用适宜的展开剂展开后取出、晾干备用； c)将经步骤b)处理后的薄层板浸渍于底物溶液中，然后取出、挥干溶剂； d)将经步骤c)处理后的薄层板浸渍于α-淀粉酶溶液中，在5?50°C进行酶促反应10?60分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂； e)将经步骤d)处理后的薄层板浸渍于显色剂溶液中进行显色反应； f)对经步骤e)显色后的薄层板进行检视:在可见光下出现的白色或黄色或棕色背景下的蓝色斑点即为α-淀粉酶抑制剂。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的酶促反应缓冲液由三羟甲基氨基甲烷与盐酸及氯化钙形成，其中的三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为25?80mmol/L。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的磷酸盐缓冲溶液由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠形成，且所形成的磷酸盐的摩尔浓度为15?25mmol/L。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的显色剂溶液由碘化钾与碘按质量比为3:1形成的碘含量为I?5mg/mL的水溶液。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的薄层板选用硅胶板、聚酰胺板、纤维素板中的任意一种。
【文档编号】G01N30/90GK105842380SQ201510014534
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月12日
【发明人】谷丽华, 江悦, 侴桂新, 王峥涛
【申请人】上海中医药大学