一种肌醇检测方法
【专利摘要】本发明的方法取血浆样品与无水乙醇混合后，加入样品浓缩玻璃管后，放入Biotage TurboVapLV多样品自动浓缩仪，调节氮气发生器产生60Psi压力的氮气，10分钟后样品氮吹至干后，加入5mL硅烷化试剂，70℃水浴中衍生反应1h，取出冷却至室温，加入5mL正己烷和10mL饱和NaCl，涡旋混匀，转移到50mL离心管中，6000rmp离心5min，取上清液用同样的方法，氮吹至干，正己烷定容至1mL。将人类血浆样品及肌醇标准品进行衍生化，并进行了衍生化技术的优化，净化提取后采用气相色谱质谱仪进行分析，使检测结果准确，样本体积最小；可应用于出生缺陷神经管畸形的血浆样本的检测。
【专利说明】
一种肌醇检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于应用基础医学研究领域，涉及气相色谱-质谱联用技术在检测血浆肌 肉肌醇水平中的应用。
【背景技术】
[0002] 肌醇，又称环己六醇，是一种无色、水溶性、味甜，耐酸、碱及热的环己烷的多元烃 基衍生物。在自然界肌肉肌醇(myo - inos i to I，MI)的分布最为广泛。在人体内，肌醇除了来 源于食物外，也可以由6-磷酸葡萄糖经肌醇合成关键酶作用在脑、睾丸及肾脏组织内合成。 大部分肌醇存在于脑、心肌和骨骼肌中。正常人脑组织中肌醇含量为血液中含量的200倍。 在细胞内，肌醇通过磷酸化与去磷酸化反应形成带有不同磷酸基团的肌醇衍生物，参与不 同的生物代谢途径，行使其功能，另一方面，细胞内的肌醇通过磷脂酸肌醇信号传导途径， 参与体内多种生化过程。已经有报道，在人体内MI代谢紊乱与多种临床疾病有关，包括神经 管畸形、阿尔茨海默病、糖尿病引起的肾小球疾病等。补充肌醇在治疗精神疾病，缓解绝经 后的代谢综合征等方面有一定的效果。因此准确的检测体内肌醇水平对于临床肌醇紊乱相 关疾病的诊疗具有一定意义。
[0003] 有关文献报道的MI检测多适用于肌醇制剂和保健食品，常用的测定方法有重量 法、高鹏酸钾氧化法、微生物法、High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry(HPLC/MS)法和Gas Chromatography Mass Spectrometer(GC/MS)法等。重量 法测定时所需样本量大、萃取剂为毒性较大的氯仿，容易污染环境;高碘酸钾氧法则要严格 控制加热氧化的时间，否则测定结果将会有很大误差;微生物法的步骤比较繁琐、费时，并 且由于需要细菌培养，使得检测容易受到生物降解物，盐类以及其他化合物的干扰。HPLC/ MS法与以上方法相比，无论从所需样本量，检测的准确性还是检测速度方面均表现出明显 的优势，但液相色谱的分离效果较气象色谱差，测试结果的误差较大，且保留时间较长。GC/ MS法是将肌醇硅烷化处理后测定，目前婴幼儿食品和乳品肌醇测定的国家标准方法即采用 气象GC/MS法。但生物样本中肌醇的检测尚无国家标准方法。在婴幼儿食品和乳品肌醇测定 的国家标准方法中，待测物质在有水的情况下进行衍生化反应，硅烷化试剂直接与水反应， 对于基质复杂的血浆样本来说，造成衍生化效率低，影响检测结果。
[0004] 如上所述，虽GC/MS法是目前比较公认的能够精确检测肌醇的方法，但对于血浆等 复杂基质的生物样本，尚缺乏准确、快速、稳定的准确方法。同时由于血浆样本的特殊性，检 测所需的样本体积，样本的存放时间等因素均可影响检测方法在临床的适用性。本发明是 在已建立的GC/MS检测混合血浆肌醇方法基础上进一步改进，以便更好地应用于临床样本 的的检测，迄今尚未见有相关报道。本发明的目的是，提供一种适用于临床检测的快速、准 确、稳定的检测血浆肌醇的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种肌醇检测方法，其可以解决现有技术中的分离和定量结 果不稳定，检测较慢的缺点。
[0006] 本发明采用以下技术方案：
[0007] 一种肌醇检测方法，包括以下步骤：
[0008] 样品处理步骤：取血浆样品与无水乙醇混合后，加入样品浓缩玻璃管后，放入 Biotage TurboVapLV多样品自动浓缩仪，调节PerMuta氮气发生器产生60Psi压力的氮气， I 〇分钟后样品氮吹至干后，加入5mL硅烷化试剂，70 °C水浴中衍生反应Ih (每I Omin取出震荡 一次），取出冷却至室温，加入5mL正己烷和IOmL饱和NaCl，涡旋混匀，转移到50mL离心管中， 6000rmp离心5min，取上清液用同样的方法，氮吹至干，正己烧定容至lmL。
[0009] 血衆样品的体积为30yL，无水乙醇的体积为I OmL。
[0010]还包括以下步骤:采用不分流式进样模式，分流比50:1，进样口温度为240°C，检测 器温度为250°C，后运行温度为270°C，后运行时间为1分钟，传输口温度为270°C，气相与质 谱接口温度为280°C;四级杆温度150°C，离子源温度230°C。以高纯度氦气为载气，流速为 lmL/min;进样量为IyL，肌醇衍生物的保留时间为7.2分钟，溶剂延迟时间为5分钟。
[0011] 以电子轰击为离子源，电子轰击能量为70eV，采用全扫描离子采集方式，通过离子 丰度比来确定待测化合物与谱图库中谱图的匹配度，进行定性，扫描时间为5min后，扫描范 围：12.00-650.OOamu，采用选择离子采集方式进行定量。
[0012] 将人类血浆样品及肌醇标准品与硅烷化试剂进行衍生化，并进行了衍生化技术的 优化，净化提取后采用气相色谱质谱仪进行分析，将定量检测系统的线性、检测线、定量线、 回收率、日间及日内差异判断方法的准确度、灵敏度和稳定性与金标准的同位素稀释法进 行了比较，同时在检测体积上进行了优化，使检测结果准确，样本体积达到最小；且可应用 于出生缺陷神经管畸形的血浆样本的检测。
【附图说明】
[0013] 下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明，其中：
[0014] 图IA是本发明的血浆肌醇衍生物在选择离子检测模式下的色谱图，
[0015] 图IB为本发明的全扫模式总离子流图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图进一步阐述本发明的【具体实施方式】：
[0017] 1.实验试剂、材料和仪器、
[0018] 肌醇（Inositol，美国Sigma公司，产品编号：15125);无水乙醇（Alcohol Anhydrous，色谱纯，美国Tedia试剂公司，产品编号:ASl 131-001 )、正己烧(n-Hexan，色谱 纯，美国Tedia公司，产品编号：HA1722-001);三甲基氯硅烷(Chlorotrimethylsilane，美国 Alfa Aesar公司，产品编号75-77-4)、六甲基二硅胺烷（美国Alfa Aesar公司，产品编号 999-97-3) ;N，N-二甲基甲酰胺(N，N-N,N-Dimethylformamide，分析纯，上海麦克林生化科 技有限公司，产品编号N807505);高纯度氦气(北京绿氧天里科技开发有限公司），硅烷化试 剂:分别取体积比为1:2:8的三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N，N-二甲基甲酰胺，超声至澄 清。
[0019] 7890A型气相色谱仪，配备5975C质谱仪（美国Agilent公司）；DB-5MS(柱长30m，内 径O · 25mm，膜厚0·25μηι，美国 Agilent 公司）；Avant i J-30I 高效离心机（美国 Beckman Coulter公司）；R_215V旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司）；Biotage TurboVapLV多样品自动浓缩 仪（英国Biotage公司）！PerMuta氮气发生器。
[0020] 2.样本前处理
[0021]取3OyL血浆样品与I OmL无水乙醇混合后，加入样品浓缩玻璃管（英文名称： Disposable Culture Tube)后，放入Biotage TurboVapLV多样品自动浓缩仪，调节PerMuta 氮气发生器产生60Psi压力的氮气，10分钟后样品氮吹至干后，加入5mL硅烷化试剂，70 °C水 浴中衍生反应Ih(每IOmin取出震荡一次），取出冷却至室温，加入5mL正己烷和IOmL饱和 NaCl，祸旋混勾，转移到50mL离心管中，6000rmp离心5min，取上清液用同样的方法，氮吹至 干，正己烷定容至ImL，上机检测。
[0022]本发明的样品前处理过程，以40个样本为单位技术，提取需要10分钟，衍生化需要 60分钟，再提取的过程为25分钟，这样总共需要95分钟，每个样本不到2分半，加上质谱的 7.2分钟。一个样本在10分钟内可以完成全部的检测。同时30ul血浆可以满足检测需要，使 得这个方法很适用于临床样本的检测。
[0023]本发明通过优化前处理步骤和过程，在样本检测的整个过程中，因为色谱分离过 程只能完成前一个样本分离检测后，才能进行下一个样本的检测。因此，缩短样本的前处理 时间对于加快检测速度就显得至关重要。因此本发明方法大大缩短了样本的处理时间，使 样本可以在短时间内完成检测。
[0024] 3.色谱与质谱条件参数
[0025] 采用不分流式进样模式，分流比50:1。进样口温度为240°C，检测器温度为250°C， 后运行温度为270°C，后运行时间为1分钟，传输口温度为270°C。气相与质谱接口温度为280 °C ;四级杆温度150°C，离子源温度230°C。以高纯度氦气为载气，流速为lmL/min;进样量为1 yL，升温程序见表1此条件下，肌醇衍生物的保留时间为7.2分钟，溶剂延迟时间为5分钟，如 图IA所示。
[0026]表1血浆肌醇检测的色谱升温程序
[0028]以电子轰击（EI)为离子源，电子轰击能量为70eV。采用全扫描离子采集方式 (SCAN)，通过离子丰度比来确定待测化合物与谱图库中谱图的匹配度，进行定性，扫描时间 为5min后，扫描范围：12.00-650.0 Oamu。采用选择离子采集方式(SIM)方式进行定量。肌醇 衍生物的母离子质量数为612. lm/z，子离子质量数为73. lm/z、147.0m/z、217. lm/z、 305. lm/z，定量离子为73. lm/z，如图IB所示。
[0029] 4、检测方法的线性、灵敏度和准确性
[0030]由于血浆中含有肌醇，且找不到完全空白血浆，因此本发明采用混合血浆样品作 为空白血浆进行加标实验，并用实验结果所得峰面积扣除空白血浆的峰面积即为加标肌醇 的峰面积，以此来对实验中各项参数的优化进行考核。取500mg/L肌醇标准品水溶液进行衍 生化后，得到2m g//L的肌醇标准品衍生化产物。将混合血浆样本进行前处理衍生化后，加入 不同量的肌醇标准品衍生化产物，使得肌醇标准品衍生化产物的浓度为20yg/L，50yg/L， 100yg/L，200yg/L和500yg/L.在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，以提取离子色谱 图的峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(X)为横坐标进行线性分析，线性方程为：Y=1.12 X 104Χ+1·04 XIO6，r2 = 0·9995，LOD为2·Oyg/L，LOQ为5·Oyg/L。
[0031 ] 分别取浓度为1.6mg/L，3.2mg/L和6.4mg/L的加入标准品的混合血衆样品作为质 控样本计算日内、日间差异及回收率。每个浓度分别取9例，在同一天的3个不同时间点测定 质控样本肌醇水平来评价本发明的日内差异。连续5天检测在同一时间检测质控样本肌醇 水平来评价本发明的日间差异，如表2所示。
[0032]表2质控血浆样本的精确度和回收率
[0034]为了验证本方法的灵敏度，专利将本方法与同位素稀释内标法进行对比，将质控 血浆样本分别加入不同含量的肌醇标品，分别用专利方法与同位素稀释法进行检测，此外 随机挑选3份临床血浆样本，每份样本等分为2份，同样分别用两种方法进行检测，结果见表 3，由此可见专利方法与"金标准"的同位素稀释方法的结果无显著差异。
[0035]表3同位素内标方法与本专利外标法检测血浆肌醇的结果比较
[0038] 5、样本检测体积的优化
[0039] 在同一份混合血浆样本中，分别取IOyL，30yL，50yL，70yL，分别进行前处理并检测 MI水平。当检测体积为30yL或以上时，检测结果的峰面积正比于样本体积，故30yL为本发明 所需的最小检测体积，如表4所示。
[0040]表4血浆肌醇检测体积的优化
[0042]综上所述，本发明建立的气象色谱-质谱联用检测血浆肌醇水平的方法，准确、稳 定、快速、简便，是一种较为理想的用于临床检测的方法，与其它方法相比，保留时间短，所 需样本量少，因此可为临床与肌醇水平相关疾病的诊疗提供检测的技术平台，也为研究肌 醇缺乏在疾病中的机制研究提供了检测基础。
[0043] 本方法通过优化前处理中的提取过程，用硼硅管进行前处理，使前处理过程可批 量进行，大大加快了检测速度。具体如下：前处理包括3个步骤:提取(extraction)，衍生化 (derivatization)，再提取(reextraction);把提取的过程进行了优化，通过硼娃管氮吹， 一个样本需要10分钟左右，可以40个样本一起做，一个样本就只用0.25分钟，大大节省了时 间，可以满足临床大量样本的检测。
[0044] 使用本发明检测方法与同位素内标检测方法进行比较，检测结果的一致性好，说 明本方法具有较高的灵敏度和准确性，可以准确的检测临床样本血浆肌醇的水平。
[0045] 运用本发明的方法，只需30微升的血浆样本即可以完成肌醇含量的检测。在前期 建立的检测方法只是在其他条件上进行了优化，并没有将样本的体积进行优化，为了便于 临床检测，减轻病人痛苦，进行了样本检测体积的优化，采集被检者的末梢血可以满足检测 需要。与采集静脉血相比，末梢血可以减轻受检者的痛苦，方便婴幼儿受检者进行检查，提 高了方法的可操作性。
[0046] 本发明通过气质联用有效结合既充分利用气象色谱的快速分离能力，又发挥了质 谱的定性专长，优势互补，可以得到较满意的分离和定量结果。相比既往重量法、高碘酸钾 氧化法、微生物法、HPLC/MS方法，结果更为准确可信。
[0047]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种肌醇检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 样品处理步骤:取血浆样品与无水乙醇混合后，加入样品浓缩玻璃管后，放入Biotage TurboVapLV多样品自动浓缩仪，调节PerMuta氮气发生器产生60Psi压力的氮气，10分钟后 样品氮吹至干后，加入5mL硅烷化试剂，70 °C水浴中衍生反应lh，取出冷却至室温，加入5mL 正己烧和10mL饱和NaCl，祸旋混勾，转移到50mL离心管中，6000rmp离心5min，取上清液用同 样的方法，氮吹至干，正己烧定容至lmL。2. 根据权利要求1所述的肌醇检测方法，其特征在于，血浆样品的体积为30yL，无水乙 醇的体积为10mL。3. 根据权利要求1所述的肌醇检测方法，其特征在于，还包括以下步骤:采用不分流式 进样模式，分流比50:1，进样口温度为240°C，检测器温度为250°C，后运行温度为270°C，后 运行时间为1分钟，传输口温度为270°C，气相与质谱接口温度为280°C ;四级杆温度150°C， 离子源温度230°C。以高纯度氦气为载气，流速为lmL/min;进样量为lyL，肌醇衍生物的保留 时间为7.2分钟，溶剂延迟时间为5分钟。4. 根据权利要求3所述的肌醇检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：以电子轰击为 离子源，电子轰击能量为70eV，采用全扫描离子采集方式，通过离子丰度比来确定待测化合 物与谱图库中谱图的匹配度，进行定性，扫描时间为5min后，扫描范围：12.00-650.OOamu， 采用选择离子采集方式进行定量。
【文档编号】G01N30/06GK105842356SQ201610169620
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月23日
【发明人】张霆, 郭金, 王建华, 张峰, 李伟清, 牛勃
【申请人】张霆, 郭金, 王建华, 张峰, 李伟青, 牛勃