一种精子质量评估的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种精子质量评估的试剂盒及其使用方 法。
【背景技术】
[0002] 随着社会工业的不断发展，不育夫妇的总发病率明显升高。2004年欧洲生殖学会 统计:育龄夫妇1年内不能怀孕者占25%，其中15%寻求治疗，男方因素引起不育占50%。男性 不育的病因有性功能障碍(1.7% )，精索静脉曲张（12. 3% )，生殖道感染(6.6%)，先天性发 育异常(2.1%)后天获得性疾病(2.6% )，内分泌紊乱(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他异常 (3%)，但是高达60%~75%的患者找不到原因，称为特发性男性不育，他们只表现为少精、弱精 或畸形精子症等精子质量异常。不明原因的男性不育可能由于多种因素造成，如长期应激 环境因素引起内分泌紊乱、活性氧和基因缺陷等。
[0003] 多年来，传统的精液常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。临 床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有三分之 一不育患者，男性的常规精液分析结果均正常和接近正常。临床上把这类患者划为不明原 因不育症。因此，长期以来，临床对男性不育的诊断存在很大的困难。最主要的原因是常规 精液分析只测定精子的数量，存活力，活动率和形态。这些指标只能反映最基本的精液质 量，不能反映所有的精子功能，比如，精子核的成熟和DNA损伤，精子与人卵透明带结合反应 与穿透，顶体状况和反应及与卵黄膜结合能力等。因此，需要建立特殊的精子功能试验才能 测定以上这些功能。精子获能是精卵结合形成受精卵的必要条件，虽然精子获能的相关研 究已有一些进展，但仍然存在很多尚未阐明的问题。
[0004] 临床工作中，一部分原发或继发的不育男性病人利用现有的常规精液质量检查项 目提示精子及精液质量无异常。目前常用的精子检测手段为CASA(计算机辅助精子分析 Computer aided of semen analysis)，以及抗精子抗体等。当今最为广泛使用的CASA技术 和一些形态学的相关检测，主要能评价精子的活动能力和活精子比率，从而推测其进入女 性生殖道的受精能力，而依赖目前的精子功能评价体系，对精子质量及功能的评价存在一 定的缺陷，以及难于给病人提供相应的临床咨询。事实上，这仅仅是评价精子功能的一个方 面，我们应该考虑到可能还有影响精子生殖能力的更多没有被揭示的因素。
[0005] 在先专利201310431847.0,提出了一种影响精子功能的唾液酸酶检测方法。第一 步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧 光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达;若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步， 利用体外获能液使精子影响精子功能的唾液酸酶检测方法获能，并用荧光法检测唾液酸酶 活性。该专利虽然公开了唾液酸酶蛋白分子在精子中的表达和基本活性的检测。但在检测 对象上，是对获能液进行的酶活测定，检测的是对精子进行获能处理后，精子向获能液中脱 落的唾液酸酶，目的是评估获能后的精子质量。由于精子本身的唾液酸酶活性与获能液的 酶活不存在必然关联，该方法无法检测精子本身所含的唾液酸酶，无法对精子本身质量进 行评估。同时，在方法上还存在以下缺点：1)技术流程复杂;2)对实验设备和操作人员技能 和经验要求高；3)不适于应用于临床实验室和常规技术人员使用;4)使用abeam公司的试剂 盒，价格昂贵。
[0006]
【发明内容】
： 针对上述技术问题，本发明提供了一种精子质量评估的试剂盒及其使用方法。对精子 提取蛋白的精子功能进行测定，采用新鲜及时的精液测定精子唾液酸酶的总活性，用于评 价男性不育的可能潜在原因，尤其是针对临床上不明原因性不育是否与唾液酸酶活性有关 的情况。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案： 一种精子质量评估的试剂盒，其特征在于:所述的试剂盒包括不含酶活抑制剂的细胞 裂解液、检测缓冲液1、蛋白酶抑制剂cocktai 1、试剂A液、试剂B液、牛血清白蛋白、焚光试 剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2。
[0008] 本发明所述的细胞裂解液不含酶活抑制剂，抑制剂会破坏唾液酸酶的活性，会影 响后面的酶活测定。
[0009] 所述的检测缓冲液1为PBS (磷酸缓冲液)或者BWW培养液。
[0010] 所述的试剂A液为：1 %BCA二钠盐，2 %无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4%氢氧化 钠，0.95 %碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3。
[0011] 所述的试剂B液为:4%硫酸铜。
[0012] 试剂A液用于提供反应原料BCA(即二喹啉甲酸)和碱性环境，试剂B液提供反应原 料二价铜离子。具体而言，B液颜色为天蓝色，当与A液混合后，颜色显示为苹果绿色，在这种 碱性条件下，加入的蛋白质可将原先的二价铜离子还原为一价铜离子，而一个一价铜离子 可螯合两个BCA分子，由此溶液颜色由苹果绿色转变为紫色。
[0013] 所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶(AUS)，浓度为5U/ml，能方便 的稀释为5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml这些浓度梯度。采用产气荚膜梭菌唾液酸酶适 用于本发明少量精子的检测方法。
[0014]所述的荧光试剂是2'-4-甲基伞形酮基-a-D-N-乙酰神经氨酸钠，具有较高的灵敏 度。
[0015] 所述Y -4-甲基伞形酮基-a-D-N-乙酰神经氨酸钠的具体结构如下：
[0016]优选地，所述荧光试剂的浓度为10mM，提供荧光试剂的浓缩液，可保证其稳定性， 不易分解和淬灭，另可减少体积，便于装盒。
[0017] 所述的检测缓冲液2为含0.05 mm〇L/L乙酸钠和0.25yg/yl牛血清白蛋白的PBS。检 测缓冲液2的缓冲体系，是针对唾液酸酶活性检测特定配制的。
[0018] 优选地，所述乙酸钠的pH值为5-6,是针对唾液酶活性最佳的工作环境。
[0019] 本发明所述精子质量评估的试剂盒的使用方法:具体步骤如下： A、精子的洗涤 收集新鲜液化精液标本，检测缓冲液1洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分 尚出精子。
[0020] 本发明先向精液标本中加入检测缓冲液1进行洗涤，再离心分离得到精子沉淀。这 是由于精浆本身黏稠，直接对其离心不能使精液中所有精子充分沉淀，加入检测缓冲液1对 其进行稀释后，离心操作效果更好。
[0021] 优选地，对精液进行3次离心，保证检测没有精浆干扰的情况下，尽可能减少离心 精子的次数，保证精子活力。
[0022] B、提取精子蛋白 向A步骤分离出的精子中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂cocktai 1，混勾，待无明显的 细胞沉淀即充分裂解，在4°C下高速离心，上清液即蛋白提取物； 蛋白酶抑制剂cocktai 1的加入是用来抑制蛋白酶的作用，蛋白酶的作用是降解蛋白 质，而本发明的待检物唾液酸酶就是一种蛋白质，加入蛋白酶抑制剂可以防止唾液酸酶被 降解。
[0023]优选地，所述裂解液的加入体积为精子体积的2-3倍，这样可保证检测的灵敏度。 [0024]优选地，所述的高速离心是指以12000r/min的速度离心5min，尽可能去掉细胞(精 子)碎片，否则这些碎片会影响检测的特异性。
[0025] C、测定精子蛋白提取物的蛋白浓度 (1)用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液，再用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/ 0.125/0mg/ml的浓度梯度将蛋白标准原液稀释为蛋白标准溶液，向检测板内依次加入各蛋 白标准溶液;加入待测样本于检测板内，再加入裂解液稀释。
[0026]优选地，用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液的浓度为20mg/ml，可 于-20°C长期储存，便于后面2/1.0/0.5/0.25/0.125/0mg/ml这些蛋白浓度梯度的配制。蛋 白标准溶液梯度根据精子提取物的蛋白浓度的表达量和本方法所能检测到的灵敏度而设 定的。
[0027] (2)按A: B=50:1的体积比配制试剂A液和B液的混合液，将其加入上述各蛋白标准 溶液和待测样本的孔内，轻轻混匀，将检测板置于37°C反应30min，然后用酶标仪读取各孔 吸光度，根据蛋白标准曲线计算出待测样本的蛋白浓度。
[0028]优选地，所述的检测板为96孔透明板。
[0029]优选地，所述的酶标仪在562nm波长下读取各孔吸光度。
[0030] 检测的孔内样本蛋白浓度应在0.1-2mg/ml范围内，如果超出，则应将孔内待测样 本的蛋白浓度调整在此线性范围之内。
[0031] D.测定精子唾液酸酶活性 (1)用检测缓冲液2将唾液酸酶