一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶i抑制剂的方法
【专利说明】一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法发明领域
[0001]本发明涉及天然产物分析领域，尤其涉及一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法;具体地说，本发明是利用超滤膜技术与色谱、质谱联用技术从天然产物提取物或其单体化合物中快速筛选拓扑异构酶I抑制剂的方法。
【背景技术】
[0002]DNA拓扑异构酶I，是广泛存在于原核和真核生物体内的一种必需酶，其催化部位的酪氨酰残基攻击DNA单链，使得酶与DNA 3’-磷酸二脂键形成共价连接，造成DNA单链的断裂，从而通过调节超螺旋、连锁、去连锁以及核酸解结作用，影响DNA拓扑结构。靶向药物是目前应用于癌症治疗的最先进的药物，它通过与肿瘤发生、生长所必需的特定靶点作用来阻止肿瘤细胞的生长。研究发现，拓扑异构酶在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达，特别是结肠癌、宫颈癌和卵巢癌等的拓扑异构酶I含量及活性远高于正常体细胞，尤其在S期肿瘤细胞中活性大幅提高。因此，拓扑异构酶I抑制剂可选择性地抑制增殖期肿瘤细胞DNA复制，阻止肿瘤细胞快速增殖，进而杀死肿瘤细胞。由于拓扑异构酶I抑制剂具有众多优越性，美国国家癌症研究所药物机制分析电脑网络系统已将拓扑异构酶I抑制剂列为重点研究的六大类抗肿瘤药物之一，该酶已成为设计新型抗癌药物的重要新靶点，对其抑制剂的研究可为肿瘤的治疗提供新的临床药物和技术手段。
[0003]拓扑异构酶I抑制剂的常规筛选法一般使用光谱法、表面等离子共振法、X射线散色法、量热法和核磁共振法等(Chenxi Yao ,Na Na ,Lingyun Huang，Dacheng He ,JinOuyang.Analytica Chimica Acta，2013，79，60—66;Vanisree Mulabagal,Angela 1.Calderon,Analytical Chemistry，2010，82，3616-3621)，上述方法方便快捷，可在一定程度上满足筛选需求。然而光谱法因存在背景干扰而易产生假阴性和假阳性结果;核磁共振检测过程不能提供快速交换反应中蛋白质-配体相互作用的详细特征等。超滤质谱连用技术结合了超滤装置优良的分离功能与质谱技术高速、高灵敏性、高准确度等特性，具有分析速度快、特异性强和高通量的特点，可便捷地识别与生物靶分子相结合的药物配体，同时样品分析用量少、谱图信息量大，在药物小分子配体和生物大分子受体相互作用研究方面具有很大的优势(Shun Xiao,Runru Yu,Ni Ai，Xiaohui Fan.Journal of Pharmaceuticaland B1medical Analysis,2015,104,67-74； Xingxin Yang,Dan Wang,Zhiwei Yang，etal.Journal of Chromatography A，2015，1413，33_46)o
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法，可用于分析天然产物提取物或者单体化合物对拓扑异构酶I体外富集率。
[0005]本发明的目的是这样实现的:
本发明所述的天然产物提取物或者单体化合物对拓扑异构酶I体外富集率是指天然产物提取物或者单体化合物与拓扑异构酶I进行孵化和结合后，受体-配体复合物经有机溶剂处理使小分子配体释放出来，用液相-质谱检测释放出来的活性化合物，计算各成分与拓扑异构酶I结合的浓度变化及其比值。
[0006]具体地说，本方法包括以下步骤:
所述的超滤质谱联用技术是指一种将超滤膜技术与色谱、质谱分析方法联合使用所形成的一种新的研究手段；
所述的拓扑异构酶I抑制剂是天然产物提取物或其单体化合物;本发明优选天然产物鼠李提取物、石蒜生物碱提取物、单体化合物重楼皂苷1、11、VI和VII;
①酶结合反应缓冲液的配制
酶结合反应缓冲液包括:
醋酸钾:50毫摩尔/升，三羟甲基氨基甲烷-醋酸:20毫摩尔/升，
醋酸镁:10毫摩尔/升，二硫苏糖醇:I毫摩尔/升；
精确称取醋酸钾4907毫克、三羟甲基氨基甲烷-醋酸2422.8毫克、醋酸镁2144.6毫克和二硫苏糖醇154.3毫克，使用去离子水溶解至终体积为I升，充分混合后，25°C下pH值为7.9;
②待测样品的配制
精确称取适量待测样品，用酶结合反应缓冲液充分溶解，待测液终浓度为1.0-3.0毫克/晕升；
所述的待测样品是鼠李提取物或石蒜生物碱提取物；
③标准溶液的配制
用乙腈将内标样品配制成浓度为100微克/毫升的标准母液，进行质谱检测前加入至待测样品液中，终浓度为2.0-5.0微克/毫升；
所述的标准品为异夏佛塔苷或荷叶碱；
④待测样品与正常和失活拓扑异构酶I的结合反应
实验组:在0.2毫升的离心管中依次加入100微升的待测样品液与10微升浓度为0.5U/微升的DNA拓扑异构酶I，37°C下孵育30分钟;将反应混合液转移至截留分子质量为3万道尔顿的超滤管中，在10000转/分钟下离心10分钟;加入200微升缓冲液洗去未结合成分，并再次在10000转/分钟下离心10分钟;重复上述步骤2次，合并滤液；向超滤管中加入200微升的90%乙腈，室温下放置10分钟后，10000转/分钟下离心10分钟，释放配体;重复上述步骤2次，合并滤液;将上述所得洗脱液吹干并加入50微升的90%乙腈溶解，用于色谱-质谱分析；
对照组:在0.2毫升的离心管中依次加入100微升的待测样品液与10微升于沸水中放置10分钟灭活的浓度为0.5 U/微升的DNA拓扑异构酶I，37°C下孵育30分钟;将反应混合液转移至截留分子质量为3万道尔顿的超滤管中，在10000转/分钟下离心10分钟；加入200微升缓冲液洗去未结合成分，并再次在10000转/分钟下离心10分钟;重复上述步骤2次，合并滤液；向超滤管中加入200微升的90%乙腈，室温下放置10分钟后，10000转/分钟下离心10分钟，释放配体;重复上述步骤2次，合并滤液;将上述所得洗脱液吹干并加入50微升的90%乙腈溶解，用于色谱-质谱分析；
⑤反应样品的色谱-质谱检测分析
以内标法定量，对步骤④中两组样品溶液进行高效液相和质谱检测;根据色谱图中各峰的峰面积与内标样品的峰面积比，计算各成分相对浓度； 对提取物待测样品、实验组和对照组样品进行高效液相色谱和质谱检测:
A、高效液相色谱的分析条件
高效液相色谱仪:Thermo Accela 600 ；
色谱柱:Waters Symmetry C18，规格为4.6X250毫米，5微米；
流动相:A-0.1%甲酸-水;B-乙腈；
梯度洗脱程序:0-5分钟，20%B ； 5-30分钟，20-70%B ； 30-35分钟，70%B ；
流速:0.6毫升/分钟；
进样量:10微升；
检测波长:360纳米；
B、质谱分析条件
质谱仪:TSQ Quantum Access MAX；
离子源:电喷雾电离源负离子模式；
分子量扫描范围:150-1500道尔顿；
二级谱扫描方式:数据依赖型扫描；
喷雾电压:3000伏特；
毛细管温度:350 °C;
鞘气压:275.8千帕；
辅助气压，氮气:55.2千帕；
⑥拓扑异构酶I对抑制剂的富集率
拓扑异构酶I对拓扑异构酶I抑制剂的富集率，可通过酶作用前后待测样品中各个色谱峰曲线下截面积(AUC)的变化进行计算评价；
分别根据未处理待测样品、与拓扑异构酶I作用前后的实验组、对照组中各个色谱峰曲线下截面积，依据如下公式计算拓扑异构酶I对拓扑异构酶I抑制剂的富集率:
EF= (A幾-細(?)/Α.X 100%
式中，EF为拓扑异构酶对I抑制剂的富集率，A幾为样品与拓扑异构酶I作用后色谱峰的截面积，仏?为样品与灭活拓扑异构酶I作用后色谱峰的截面积，A待；I为未与拓扑异构酶I发生作用的待测样品中色谱峰的截面积。
[0007]本发明具有下列优点和积极效果:
①将超滤膜技术与色谱、质谱联用技术联用方法应用到拓扑异构酶I抑制剂的筛选中，样品分析速度快、特异性强，可方便地识别与生物靶分子相结合的药物配体；
②同时样品分析用量少、谱图信息量大，可实现先导化合物的快速筛选，在药物小分子配体和生物大分子受体相互作用研究方面具有很大的优势；
③适用于分析天然产物提取物或者单体化合物对拓扑异构酶I体外富集率。
[0008]
【附图说明】
[0009]图1为本发明的步骤流程图；
图2为实施例1中鼠李提取物经超滤步骤后所得活性成分的液相色谱图，
检测波长360纳米，线a表示未与拓扑异构酶I发生作用的鼠李提取物成分液相色谱图，线b和线C分别表示实验组和对照组所得鼠李活性成分的液相色谱图，内标品(IS)为异夏佛塔苷；
图3为实施例1中液相色谱图峰3(芹黄素)的多反应监测负离子模式的提取色谱图，
提取所用离子为母离子269.04，信号强度为7.14 X 17;
图4为实施例1中液相色谱图峰4(槲皮素)的多反应监测负离子模式的提取色谱图，
提取所用离子为母离子301.00,信号强度为3.72X 16;
图5为实施例1中液相色谱图峰5(鼠李柠檬素)的多反应监测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子为母离子298.90，信号强度为1.69 X 16;
图6为实施例1中液相色谱图峰6(樱花素)的多反应监测负离子模式的提取色谱图，
提取所用离子为母离子284.99，信号强度为1.06 X 17;
图7为实施例1中液相色