一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物抗逆性鉴定技术，具体是指一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方 法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 受全球气候变暖的影响，环境变化程度增大，春夏季寒流天气频繁，对已进入生长 发育期的植物造成严重威胁，引起草原植被群落的变迁和结构的改变，尤其在农业生产中 造成很大的减产，甚至绝收。另外，在农业生产过程中，随着化肥的投入使用，±壤盐碱化问 题愈加突出，对农作物造成一定程度的盐害，严重影响农业生产。抗逆性强的植物在逆境胁 迫中产出性能强，减产小。因此，通过选育抗逆性强的植物新品种是改良植物抗逆性，保持 农牧业增收的有效途径。
[0004] 植物抗逆性快速鉴定的方法是植物抗逆育种的关键技术，一直受到研究者的关 注，但传统的形态鉴定法不能对抗逆性进行量化分析，分子鉴定技术成本高，操作难度大且 耗时，要求精密仪器才能完成。电导率法虽然能反映细胞的完整性，但测定时误差难W控 审IJ。由于植物细胞为双憐脂分子层通透性膜，中间镶嵌大量蛋白质和糖类分子，具有渗透调 节功能，也具有双向选择透性。当植物受到低溫冷冻、盐碱非生物环境因子胁迫后，机体内 抗氧化系统失衡，自由基积累，一些蛋白质被降解为游离氨基酸，膜蛋白降解后从生物膜脱 落下来，破坏了生物膜系统结构，造成生物膜不同程度出现孔桐，细胞内含物开始向外泄 露，介质中游离氨基酸增多。不同程度的环境胁迫引起蛋白质降解的程度不同，造成氨基酸 泄露的程度就不同。然而，抗逆性强的植物具有较强的抗氧化系统，能及时清除多余的自由 基，维持体内自由基的稳定和平衡，保护功能蛋白质不被降解，保持膜系统的完整性。因此， 当植物遭到逆境胁迫后，抗逆性强的植物生物膜系统稳定，蛋白质相对稳定，氨基酸泄露率 低。根据自由基学说、生物膜损伤原理和蛋白质稳定性原理，可通过测定植物组织细胞氨基 酸泄漏的程度，来衡量生物膜系统的完整性和蛋白质的稳定性，运对于鉴定植物的抗逆性 和选育抗逆性强的植物新品种均有着实际的应用价值。
【发明内容】
[0005] 鉴于上述，本发明的目的在于提供一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法。本方 法利用氨基酸在28化m处有一吸收高峰为依据，W杀死组织后280nm吸光度为参照，通过试 验准备-准备样品-浸提-离屯、-去除杂蛋白干扰-测定鲜组织吸光度-高压灭杀-合并离屯、-测定杀死组织吸光度，最后计算氨基酸泄露率。
[0006] 本发明的目的是通过W下技术方案来实现： 一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法，其步骤是： a.试验准备 根据试验处理数，准备足量5-lOml带螺盖离屯、管，用无离子水洗净后烘干备用； b.准备样品 处理前用蒸馈水冲洗待测植物组织，用滤纸吸干表面水分；处理结束，准确称取各处 理植物新鲜组织0.0401-0.0509 g，置a步骤准备的离屯、管中； C.浸提 在b步骤含植物新鲜组织的离屯、管中各加入4mL蒸馈水，在室溫条件下，浸提2-3 h，摇 床轻摇浸提3 h; d. 罔心 浸提结束，立即将C步骤的浸提管放置在转速为3000rev/min的离屯、机离屯、5-10分钟； e. 去除杂蛋白干扰 上述d步骤离屯、结束，吸取浸提管中的上清液3.0 ml，转入另一测试管，加入0.3ml的 72%(w/v)S氯乙酸(TCA)溶液，再在3000rev/min离屯、5-10分钟，W沉淀去除杂蛋白干扰； f. 测定鲜组织的吸光度 将e步骤离屯、后的测试管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度计读取波长280nm的吸光 度值A280nm，空白为蒸馈水，获得鲜组织在波长280nm的吸光度值A280皿，测定后将比色杯 液体倒回测试管中； g. 局压灭杀 将e步骤吸取上清液后留有植物组织和Iml浸提液的浸提管上盖置高压灭菌锅灭杀 20min，浸提管称之灭杀管； h. 合并离屯、 将e步骤测试管测试液全部回倒入其g步骤对应灭杀管中，合并后再在3000rev/min离 屯、5-10分钟，W沉淀去除杂蛋白干扰； i. 测定杀死组织的吸光度 将上述h步骤合并离屯、的灭杀管上清液倒入比色杯，空白为蒸馈水，再次测定吸光度值 Ak280nm，即为杀死样品在波长280nm的吸光度值Ak280nm; j. 计算氨基酸泄漏率 氨基酸泄漏率为各处理鲜组织在波长280nm的吸光度值A280nm占杀死样品在波长 280nm的吸光度值Ak280nm的比率，按下列公式计算： 氨基酸泄漏率(％)=A280nmX 100/Ak280nm。
[0007]本发明的优点和产生的有益效果是： 1、本发明根据自由基学说和生物膜损伤机制，利用游离氨基酸在280nm处有一吸收高 峰为依据，W杀死组织后280nm吸光度作为游离氨基酸100%泄漏的参照值，通过测定各处理 鲜组织280nm吸光度，最后计算氨基酸泄露率，成本低廉，方法简单，处理间可比性强，在植 物抗逆性鉴定中应用成效显著。
[000引2、本发明关键技术步骤在于样品经浸提、离屯、、去除杂蛋白干扰、通过测定鲜组织 和杀死组织280nm的吸光度，计算出氨基酸泄露率。在运一步骤中，鲜样和杀死样为同一样 品，一次称样即可完成测定，样品用量少，取样部位灵活，鲜样和杀死样在280nm的吸光度值 可比性强，不存在因样组织部位和质量的不同造成280nm吸光度值的差异，测定误差小。
[0009] 3、利用本方法测定氨基酸泄漏率快速方便，整个测定工作耗时不到地，可对一次 试验各处理成批测定，处理间可比性强，稳定性好，可快速鉴定植物的抗低溫冷冻性和抗盐 性，在植物抗逆性研究中应用性广。
[0010]
【具体实施方式】： 下面，本发明结合实施实例，对本发明的技术方案再作进一步的说明： 实施例1 为了鉴定瓜果生长期间对寒流引起的冷、冻害的抗性，本发明采用抗寒性有差异的西 瓜品种京欣1号和晚丰早成品种，将出苗后在23/25°C培养30d的幼苗在4°C和(TC处理2地， 用25°C作为对照。测定京欣1号和晚丰早成西瓜在冷、冻胁迫下子叶氨基酸泄露率的变化。 试验在中国科学院寒区旱区环境与工程研究所分子生物学实验室进行，测定试验重复3次。
[0011] -种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法，其步骤是： 1. 试验准备 根据试验处理数，准备36个IOml带螺盖离屯、管，用无离子水洗净后烘干备用； 2. 准备样品 将室内溫度为23/25C条件下播种出苗并生长IOd的西瓜品种京欣1号和晚丰早成幼苗 用蒸馈水冲洗，用滤纸吸干表面水分，然后置4°C和(TC处理2地，对照留在23/25°C，处理结 束，准确称取各处理幼苗子叶3份，作为3次重复，每份0.0401-0.0409 g，分别置上述离屯、管 编号； 3. 浸提 在上述含子叶的离屯、管中各加入4血蒸馈水，在23/25°C条件下浸提2-3 h，期间每隔30 分钟轻摇1次或置摇床轻摇浸提； 4. 离屯、 轻摇结束，立即将浸提管放置在转速为3000rev/min的离屯、机离屯、10分钟； 5. 去除杂蛋白干扰 吸取浸提管中上清液3.0 ml转入另一测试管，加入0.3ml的72%(w/v)S氯乙酸(TCA)溶 液，再在转速为3000rev/min的离屯、机离屯、10分钟，W沉淀去除杂蛋白干扰； 6. 测定鲜样品的吸光度 将测试管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度计读取波长280nm的吸光度值A280nm，空 白为蒸馈水，获得鲜组织在波长280nm的吸光度值A280nm，测试结束将比色杯液体全部回收 入测试管中； 7. 局压灭杀 将吸取浸提液后含有子叶和Iml浸提液的浸提离屯、管置高压灭菌锅灭菌20min，冷却后 与对应测试管浸提液合并； 8. 离屯、 将含合并液的杀灭离屯、管在转速为3000rev/min的离屯、机离屯、10分钟，W沉淀去除杂 蛋白干扰； 9. 测定杀死样品的吸光度 将上述合并离屯、的灭杀管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度计读取波长28化m的吸 光度值A280nm，空白为蒸馈水;再次测定吸光度值Ak280nm，即为杀死样品在波长28化m的吸 光度值Ak280nm; 10. 计算氨基酸泄漏率 氨基酸泄漏率为各处理子叶在波长280nm的吸光度值A280nm占高压杀死子叶在波长 280nm的吸光度值Ak280nm的比率，按下列公式计算： 氨基酸泄漏率(％)=A280nmX 100/Ak280nm 表1西瓜品种京欣I号幼苗分别经4°C和(TC处理24h氨基酸泄露率的比较
表1表明，对照23/25°(：条件下京欣1号平均氨基酸泄漏率为5.22%，标准误为1.11%，95% 置信区间为[0.44%，9.99%]; 4 °C处理2地平均氨基酸泄漏率为3.91%，标准误为0.26%，95%置 信区间为[2.79%，5.02%];(TC处理2地平均氨基酸