胰肿瘤的检测方法、抗体和胰肿瘤检测用试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及胰肿瘤、即胰癌或胰良性肿瘤的检测方法、用于该方法的抗AP0A2抗体 和包含该抗体的胰癌或胰良性肿瘤检测用试剂盒，所述检测方法包括使用与AP0A2蛋白质 特异性结合的抗体(抗AP0A2抗体)来测定受试体样品中的AP0A2蛋白质变异体的量。
【背景技术】
[0002] 根据2012年的统计，在日本主要的死亡原因的第1位是癌。癌的特征在于，从正常 组织产生、由癌细胞的异常增殖引起的肿瘤块的形成，形成肿瘤块的癌细胞向邻近组织的 浸润，以及经由血管、淋巴管向多种脏器的远处转移。已知在这样的癌发病和发展时，血液、 尿等患者的体液中各种蛋白质的浓度发生变动，这样的蛋白质被称为肿瘤标志物(癌检测 用标志物），被期待在癌的早期发现、治疗后的经过观察等各种诊断用途中应用(例如，专利 文献1~3)。然而，可用于临床诊断的以往的肿瘤标志物大多阳性率为50~70%程度，特别 是在早期癌中，存在大部分肿瘤标志物显示假阴性这样的问题。由于以向邻近组织的浸润、 远处转移为特征的晚期癌、末期癌会预后不良，因此早期发现对于癌的有效治疗是重要的。 因此，期待发现能够检测早期癌、灵敏度优异的肿瘤标志物。
[0003] 胰肿瘤是指在胰脏形成的全部肿瘤，分为作为恶性肿瘤的胰癌、和作为良性肿瘤 的胰良性肿瘤。
[0004] 胰癌在众多癌症中作为难治性癌症的一种而为人所知，尚未确立除了外科手术以 外的有效的治疗法，因此早期发现、防止其发病于未然变得特别重要。作为胰癌的诊断方 法，可使用血清肿瘤标志物、螺旋CT、磁共振装置(MRI)、超声内镜检查法(EUS)等(非专利文 献1)。然而，胰癌在早期阶段缺乏症状，在大多数情况下，已经形成晚期癌才被发现，因此一 般来说治疗困难。因此，期望开发能够准确且简易地发现胰癌的新的诊断技术。
[0005] 另一方面，胰良性肿瘤是胰癌前阶段的病态，暗示了与胰癌发病相关。但是，与胰 癌相比，胰良性肿瘤预后良好，期待通过利用外科手术摘出来防止胰癌的发病。因此，可以 认为胰良性肿瘤的早期发现也重要。
[0006] AP0A2(Apolipoprotein A2(载脂蛋白A2)或Apolipoprotein A-II(载脂蛋白A-Π ))蛋白质(GenBank登录号NP_001634.1)是构成血楽;脂蛋白的载脂蛋白家族的一种。载脂 蛋白迄今为止已知10种以上，它们的主要功能是脂蛋白的结构的稳定化、与脂蛋白代谢相 关的酶的活化、作为针对细胞表面存在的脂蛋白受体的配体的作用等。AP0A2蛋白质在肝脏 组织中作为包含信号肽的100个氨基酸的前体被合成，血液中存在的成熟型包含77个氨基 酸。成熟型AP0A2蛋白质，其氨基末端(N末端)有谷氨酰胺残基(Q)、从N末端数第76位有苏氨 酸残基(T)、第77位的C末端有谷氨酰胺残基(Q)，是构成高密度脂蛋白（HDL)的载脂蛋白之 一。此外，报告了AP0A2蛋白质中存在作为完全长度AP0A2蛋白质的AP0A2-ATQ蛋白质、作为 缺失了 C末端的谷氨酰胺残基(Q)的AP0A2蛋白质的AP0A2-AT蛋白质、作为缺失了 C末端的苏 氨酸·谷氨酰胺残基(TQ)的AP0A2蛋白质的AP0A2-A蛋白质等质量不同的变异体(非专利文 献2)。
[0007] 根据基于登录在蛋白质结构数据库（PDB;Protein Data Bank;http:// www.rcsb. org/pdb/home. do)的AP0A2蛋白质的立体结构数据(PDB ID: 1L6L)的解析，认为 AP0A2蛋白质通过介由N末端侧的半胱氨酸残基的二硫键(SS键)而形成二聚体。因此，已知 AP0A2蛋白质在血液中作为由前述3种变异体的组合产生的各种分子量的二聚体而存在。具 体而言，已知由完全长度的AP0A2-ATQ蛋白质组成的二聚体(AP0A2-ATQ/ATQ蛋白质二聚 体）、AP0A2-ATQ蛋白质和AP0A2-AT蛋白质的二聚体(AP0A2-ATQ/AT蛋白质二聚体）、由 AP0A2-AT蛋白质组成的二聚体(AP0A2-AT/AT蛋白质二聚体）、AP0A2-AT蛋白质和AP0A2-A蛋 白质的二聚体(AP0A2-AT/A蛋白质二聚体）、由AP0A2-A蛋白质组成的二聚体(AP0A2-A/A蛋 白质二聚体)等。此外，除此以外，还已知AP0A2蛋白质通过二硫键与APOD蛋白质、APOE蛋白 质、APOAl-M蛋白质等其他蛋白质形成二聚体，或者作为单体而存在(非专利文献3、4)。
[0008] 已知对于上述各种AP0A2蛋白质二聚体，与健常者相比，在胰癌患者的血中显示量 的变动。特别是AP0A2-ATQ/AT蛋白质二聚体，质量分析的结果作为具有分子量17253±9(m/ z)的质量值的蛋白质被发现，已经明确与健常者相比在胰癌患者中显著减少，以及通过利 用该蛋白质二聚体作为胰癌标志物，能够以AUC(area under the curve:曲线下面积)值为 0.85以上的高精度检测出胰癌(专利文献4、5，非专利文献5)。
[0009] 然而，为了达到前述AUC值的判别精度，需要包括利用质量分析器进行测定在内的 3个繁杂的工序。例如，在最初的工序中，对质量分析中使用的血液样品使用9M尿素、2 % CHAPS进行前处理。然而，尿素容易分解、不适合长期的保存，因此为了备齐前处理条件，需 要在每次测定时调制包含尿素的溶液。此外，在接下来的工序中，将进行了前处理的样品捕 获在蛋白质芯片（f7 7 - 工^，彳才シ只于A社制）的表面。在该捕获工序中，利用 蛋白质芯片表面的带电状态、疏水性等特性进行吸附，因此可知洗涤条件、试剂的调制条件 较大地影响捕获效率。在最后的工序中，利用质量分析器来进行捕获样品的测定。质量分析 器要求对激光强度的调整等操作熟练，而且在处理受试体上的通量低。进而，在样品中包含 众多不同的蛋白质的情况下，从各蛋白质得到的信号彼此相互干扰，因而信号的归属变得 困难。而且，由于定量性也存在问题，因此不适合需要高精度测定的诊断用途。因此，存在实 用化障碍高这样的问题。
[0010] ELISA法作为与质量分析法相比在评价大量的样品上通量高、便宜且实用的方法 而为人所知。此外，ELISA法是通用的方法，因此不需要对操作熟练，而且，由于使用2种抗 体，因此特异性高，使用标准物质能够实现再现性好的定量。因此，能够全面且定量性高地 解析在样品中以各种分子量存在的AP0A2蛋白质变异体。
[0011]在先技术文献 [0012]专利文献
[0013] 专利文献1:日本特开2001-289861号公报 [0014] 专利文献2:日本特开2002-323499号公报 [0015] 专利文献3:日本特开2009-034071号公报
[0016] 专利文献4:国际公开第2006/098087号
[0017] 专利文献5:日本特开2010-175452号公报 [0018]非专利文献
[0019]非专利文献1:科学的根拠 K基d〈脾癌診療力' Y K y 基于科学的根据的胰 癌诊疗指南)2009年版、日本脾臓学会脾癌診療力' Y K y Y ^改訂委員（日本胰脏学会胰癌 诊疗指南改订委员），金原出版
[0020] 非专利文献2:Pankhurst G.等，2003年，J Lipid Res，第44卷，P.349-355
[0021] 非专利文献3:Blanc〇-Vaca F.等，2001 年，J Lipid Res，第42卷，ρ·1727-1739
[0022] 非专利文献4:Rocco AG.等，2006年，Biophys J，第91 卷，ρ·3043-3049
[0023] 非专利文献5:Honda K.等，2012年，PLoS One，第7卷，p.e46908
【发明内容】
[0024]发明所要解决的课题
[0025]通常，肿瘤的检测使用肿瘤标志物，但是已知胰肿瘤难以利用肿瘤标志物进行检 测。胰肿瘤中，特别是早期的胰癌患者与健常者难以辨别，因此使用肿瘤标志物的胰癌的早 期检测非常困难。此外，关于能够检测胰良性肿瘤的肿瘤标志物，迄今为止基本未知。
[0026]本发明的课题是提供利用胰肿瘤标志物AP0A2蛋白质变异体，具有胰肿瘤、即胰癌 或胰良性肿瘤的高检测灵敏度，并且比前述专利文献4、5和非专利文献5中记载的检测方法 简便、通量高的胰肿瘤的检测方法和胰肿瘤检测用试剂盒。
[0027]用于解决课题的方法
[0028]为了解决上述课题，本发明者们首先旨在开发以AP0A2-ATQ/AT蛋白质二聚体为对 象利用了 ELISA测定法的胰癌的检测方法。然后，尝试了基于通常进行的方法，使用针对构 成AP0A2-ATQ/AT蛋白质二聚体的AP0A2-ATQ蛋白质和AP0A2-AT蛋白质各自的C末端区域的 抗体(抗AP0A2蛋白质末端抗体），来检测AP0A2-ATQ/AT蛋白质二聚体。然而，可能由于血中 存在的妨碍物质、在2种抗体结合于同一抗原时引起的空间位阻的影响，判明了不能高精度 地检测该二聚体。
[0029]因此，本发明者们反复进行了深入研究，确立了通过应用夹心ELISA法，来分别测 定AP0A2-ATQ蛋白质的总量和AP0A2-AT蛋白质的总量的方法，所述夹心ELISA法组合了与前 述C末端区域特异性结合的抗AP0A2蛋白质末端抗体、和与AP0A2蛋白质的除了 C末端区域以 外的区域特异性结合的抗体(抗AP0A2蛋白质非末端抗体）。进而，通过适用分别测定AP0A2-ATQ蛋白质的总量的测定值和AP0A2-AT蛋白质的总量的测定值，将其结果进行组合的解析 法，而不是以往进行的测定AP0A2-ATQ/AT蛋白质二聚体的量，能够高精度地判别胰癌患者 与健常者。进而，通过使用该解析法，发现了通过迄今为止报告的肿瘤标志物不可能实现的 胰良性肿瘤的检测这样预料不到的效果。发现了基于该技术，能够以极高灵敏度检测出包 含胰良性肿瘤、早期胰癌在内的胰肿瘤，从而完成了本发明。
[0030] 本发明包含以下的发明。
[0031] (1)胰肿瘤的检测方法，是测定受试体的体液样品中AP0A2蛋白质变异体的量来检 测胰肿瘤的方法，包括：
[0032] (A)第1工序，使用与AP0A2-ATQ蛋白质的C末端区域特异性结合的抗AP0A2-ATQ末 端抗体、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的抗AP0A2-ATQ非末端抗体，来测定 样品中的AP0A2-ATQ蛋白质的量，所述AP0A2-ATQ蛋白质由序列号1所示的氨基酸序列组成， [0033] (B)第2工序，使用与AP0A2-AT蛋白质的C末端区域特异性结合的抗AP0A2-AT末端 抗体、和与除了该C末端区域以外的氨基酸序列结合的抗AP0A2-AT非末端抗体，来测定样品 中的AP0A2-AT蛋白质的量，所述AP0A2-AT蛋白质由序列号2所示的氨基酸序列组成，
[0034] (C)第3工序，将由第1工序获得的AP0A2-ATQ蛋白质的量的测定值和由第2工序获 得的AP0A2-AT蛋白质的量的测定值输入预先设定的判别式而获得受试体的判别值，在该受 试体的判别值与健常体的测定值或判别值相比在统计学上有显著性差异时，确定受试体罹 患胰肿瘤。
[0035] (2)根据（1)所述的检测方法，AP0A2-ATQ蛋白质和AP0A2-AT蛋白质的所述C末端区 域分别由包含6个以上连续氨基酸的序列组成，所述6个以上连续氨基酸包含C末端在内。 [0036] (3)根据（1)或(2)所述的检测方法，前述判别式是选自逻辑回归式、利用支持向量 机的解析制作的判别式、利用神经网络的解析制作的判别式以及利用判别分析的解析制作 的判别式中的任一种。
[0037] (4)根据（3)所述的检测方法，前述逻辑回归式包含AP0A2-ATQ蛋白质的前述测定 值、和/或AP0A2-AT蛋白质的前述测定值、和/或AP0A2-ATQ蛋白质的前述测定值与AP0A2-AT 蛋白质的前述测定值的积作为变量。
[0038] (5)根据(4)所述的方法，由前述逻辑回归式获得的受试体的判别值是健常体的判 别值的三分之二以下。
[0039] (6)根据(1)~(5)中任一项所述的检测方法，前述胰肿瘤是胰癌或胰良性肿瘤。
[0040] (7)根据(6)所述的检测方法，还包括第4工序:对于在前述第3工序中已确定罹患 胰肿瘤的受试体，测定该受试体的体液样品中的胰癌标志物CA19-9或DU-PAN-2的量，在其 测定值超过规定基准值的情况下，确定受试体罹患胰癌;在其测定值为该基准值以下的情 况下，确定受试体罹患胰良性肿瘤。
[0041] (8)根据(1)~(7)中任一项所述的检测方法，前述体液样品是血液、血浆、或血清。
[0042] (9)根据(1)~(8)中任一项所述的检测方法，前述胰癌是早期胰癌。
[0043] (10)单克隆抗体或其片段，该单克隆抗体是与AP0A2-ATQ蛋白质的C末端区域特异 性结合的抗AP0A2-ATQ末端抗体，所述AP0A2-ATQ蛋白质由序列号1所示的氨基酸序列组成， 该单克隆抗体的重链的⑶Rl、CDR2和⑶R3分别由序列号4、5和6所示的氨基酸序列组成，且 轻链的⑶Rl、⑶R2和⑶R3分别由序列号7、8和9所示的氨基酸序列组成。
[0044] (11)单克隆抗体或其片段，该单克隆抗体是与AP0A2-ATQ蛋白质的C末端区域特异 性结合的抗AP0A2-ATQ末端抗体，所述AP0A2-ATQ蛋白质由序列号1所示的氨基酸序列组成， 该单克隆抗体的重链的⑶R1XDR2和⑶R3分别由序列号10、11和12所示的氨基酸序列组成， 且轻链的⑶RU⑶R2和⑶R3分别由序列号13、14和15所示的氨基酸序列组成。
[0045] (12)单克隆抗体或其片段，该单克隆抗体是识别AP0A2蛋白质的除C末端区域以外 的氨基酸序列的抗AP0A2蛋白质非末端抗体，所述AP0A2蛋白质由序列号1~3中任一项所示 的氨基酸序列组成，该单克隆抗体的重链的⑶Rl、⑶R2和⑶R3分别由序列号16、17和18所示 的氨基酸序列组成，且轻链的⑶Rl、CDR2和⑶R3分别由序列号19、20和21所示的氨基酸序列 组成。
[0046] (13)单克隆抗体或其片段，该单克隆抗体是识别AP0A2蛋白质的除C末端区域以外 的氨基酸序列的抗AP0A2蛋白质非末端抗体，所述AP0A2蛋白质由序列号1~3中任一项所示 的氨基酸序列组成，该单克隆抗体的重链的⑶Rl、⑶R2和⑶R3分别由序列号22、23和24所示 的氨基酸序列组成，且轻链的⑶Rl、CDR2和⑶R3分别由序列号25、26和27所示的氨基酸序列 组成。
[0047] (14)胰肿瘤的检测用试剂盒，包含1种以上前述(10)~（13)所述的抗体或其片段。
[0048]本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2013-206682号、2014-166188号的说明书和/或附图所记载的内容。
[0049]发明的效果
[0050]根据本发明，能够通过测定血中的胰肿瘤标志物AP0A2蛋白质变异体，来简便、高 通量且高灵敏度地检测胰肿瘤。例如，仅通过测定从患者采集的血液等体液样品中包含的 特定的AP0A2蛋白质变异体的量，就能够确定该患者是否罹患胰肿瘤、或者评价罹患的可能 性。
【附图说明】
[0051 ]图I(A)是测定作为抗AP0A2-ATQ末端单克隆抗体的克隆7F2对AP0A2蛋白质的各种 变异体的结合活性而得的图。图I(B)是测定作为抗AP0A2-ATQ末端单克隆抗体的克隆6G2对 AP0A2蛋白质的各种变异体的结合活性而得的图。
[0052] 图2(A)是测定抗AP0A2-ATQ末端单克隆抗体7F2、6G2或抗AP0A2-ATQ末端多克隆抗 体（图中标记为多抗)对AP0A2-ATQ蛋白质或AP0A2-AT蛋白质的结合活性而得的图。图2(B) 是用由（A)获得的前述抗体对AP0A2-ATQ蛋白质的结合活性的测定值除以对AP0A2-AT蛋白 质的结合活性的测定值，来评价抗体的结合特异性的图。
[0053]图3是测定抗AP0A2-AT末端多克隆抗体对AP0A2蛋白质的各种变异体的结合活性 而得的图。
[0054]图4(A)是测定作为抗AP0A2蛋白质非末端单克隆抗体的MABl对AP0A2蛋白质的各 种变异体的结合活性而得的图。图4(B)是测定作为抗AP0A2蛋白质非末端单克隆抗体的 MAB2对AP0A2蛋白质的各种变异体的结合活性而得的图。
[0055]图5是通过质量分析法测定胰癌患者和健常者各40名的血浆中包含的AP0A2蛋白 质二聚体(AP0A2-ATQ/AT)而得的图。
[0056]图6是通过夹心ELISA法测定胰癌患者和健常者各40名的血浆中包含的AP0A2蛋白 质二聚体(AP0A2-ATQ/AT)而得的图，所述夹心ELISA法使用了特异性识别AP0A2-ATQ蛋白质 的C末端区域的氨基酸序列的单克隆抗体(抗AP0A2-ATQ末端单克隆抗体）和特异性识别 AP0A2-AT的C末端区域的氨基酸序列的多克隆抗体(抗AP0A2-AT末端多克隆抗体抗体）。 [0057]图7是通过夹心ELISA法测定胰癌患者和健常者各40名的血浆中包含的AP0A2-ATQ 蛋白质而得的图，所述夹心ELISA法使用了特异性识另UAP0A2-ATQ蛋白质的C末端区域的氨 基酸序列的单克隆抗体(抗AP0A2-ATQ末端单克隆抗体)和特异性识别除了 C末端区域以外 的氨基酸序列的抗体(抗AP0A2-ATQ非末端抗体）。
[0058]图8是通过夹心ELISA法测定胰癌患者和健常者各40名的血浆中包含的AP0A2-AT 蛋白质而得的图，所述夹心ELISA法使用了特异性识别AP0A2-AT蛋白质的C末端区域的氨基 酸序列的多克隆抗体(抗AP0A2-AT末端多克隆抗体)和特异性识别除了 C末端区域以外的氨 基酸序列的抗体(抗AP0A2-AT非末端抗体）。
[0059]图9是将胰癌患者和健常者各40名的血浆中包含的2种AP0A2蛋白质变异体 (AP0A2-ATQ蛋白质和AP0A2-AT蛋白质）的量的积作图而得的图。
[0060] 图10是将胰癌患者244名和健常者109名的血浆中包含的2种AP0A2蛋白质变异体 (AP0A2-ATQ蛋白质和AP0A2-AT蛋白质）的浓度作图而得的图。
[0061] 图11是将胰癌患者(UICC分类中的I期、II期)和健常者的测定值代入逻辑回归式， 制作ROC曲线而得的图。（A)表示对于2种AP0A2蛋白质变异体(AP0A2-ATQ蛋白质和AP0A2-AT 蛋白质）的夹心ELISA法测定值的积进行解析而得的结果，（B)表示通过质量分析法对于 AP0A2蛋白质二聚体(AP0A2-ATQ/AT)进行解析而得的结果。
[0062]图12是将胰良性肿瘤患者和健常者的测定值代入逻辑回归式，制作ROC曲线而得 的图。（A)表示对于利用夹心ELISA法测定的、2种AP0A2蛋白质变异体(AP0A2-ATQ蛋白质和 AP0A2-AT蛋白质）的测定值的积进行解析而得的的结果，（B)表示对于CA19-9的测定值进行 解析而得的结果。
【具体实施方式】
[0063]成为本发明的测定对象的是胰肿瘤。在本说明书中，"胰肿瘤"是指在胰脏中形成 的全部肿瘤。具体而言，是作为恶性肿瘤的"胰癌"和作为良性肿瘤的"胰良性肿瘤"。
[0064] 在本说明书中，所谓"胰癌"，是指在胰脏中形成的全部恶性肿瘤。具体而言，包含 浸润性胰导管癌、胰导管内管状腺癌、胰腺房细胞癌、胰浆液性囊胞腺癌、胰粘液性囊胞肿 瘤(胰粘液性囊胞肿瘤的一种）、胰导管内乳头粘液性肿瘤(胰导管内乳头粘液性肿瘤的一 种）、胰神经内分泌肿瘤(胰内分