高稳定性的表面增强拉曼光谱的液相检测装置及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于激光共聚焦拉曼光谱检测领域，具体来说，涉及一种高稳定性的表面增强拉曼光谱的液相检测装置及检测方法。
【背景技术】
[0002]拉曼光谱是一种散射光谱。光照射到物质上发生弹性散射和非弹性散射，弹性散射的散射光是与激发光波长相同，非弹性散射的散射光有比激发光波长长的或短的成分，统称为拉曼效应。拉曼效应起源于分子振动与转动，因此拉曼光谱能够提供分子内部各种简正振动频率及其振动能级情况，从而鉴定分子中存在的官能团、分子特征结构及其所处的环境。利用拉曼光谱技术对样品进行检测和鉴别具有非接触、无破坏等优点，无需特殊样品制备步骤，并且由于水对拉曼光谱的影响非常小，所以拉曼光谱可以被广泛地应用于生物体系中具备生物活性样品的检测。然而拉曼散射光谱的强度仅为入射光强的10—1()，信号太弱以致难以收集检测。近年来，随着纳米技术的不断发展，表面增强拉曼散射光谱技术(Surface Enhanced Raman Scattering，SERS)的出现极大的提高了拉曼光谱技术的检测灵敏度。当具有拉曼活性的分子与金属纳米结构接触时，通过金属纳米结构的电磁增强和化学增强效应作用，能够使分子的拉曼光谱得到极大增强，增强能力达14?107。因此，基于SERS的拉曼检测技术在超灵敏检测中已有广泛应用。
[0003]但是长久以来，基于SERS的拉曼检测技术只能够对样品进行定性的分析，极大地限制其在定量分析领域中的应用，造成这一结果最为关键一点就是缺少简单易行的手段将纳米结构排列成均匀的SERS基底，从而在不同的基底区域获得均匀一致可重复的SERS信号。通过离子束或电子束光刻技术能够获得大范围均匀的金属纳米结构阵列，用作可重复的SERS基底，但该方法需要大型设备，花费大产出低。较常用的方法就是将金属纳米颗粒与拉曼活性分子的混合溶液滴在硅片上，等液滴干燥后直接对硅片表面混合物质检测，由于干燥过程中“咖啡环”效应而导致干燥后的液滴区域内物质分布不均，液滴边缘浓度大，而中间区域稀少，从而导致SERS信号严重不均匀，同一个基片上不同点测得的拉曼信号强度千差万别无法重复，虽然方法简单，但只能用于定性分析。此外，静电吸附组装方法制备SERS基底也得到广泛应用。通过静电吸附作用，可以将带电金属纳米颗粒均匀铺散在硅片表面得到均一 SERS基底，但由于颗粒结构和尺寸不同导致沉降速率不一样，在硅片表面通过静电吸附形成的颗粒阵列密度不同，因此也无法定量评价不同金属纳米颗粒之间的SERS活性的相对高低。传统表面增强拉曼光谱检测方法耗时、耗力且效果不佳这些问题，无法满足样品的简单、快速、准确定量分析要求。因此本团队将注意力从固相加测转移到液相检测中来，因为固相检测的不确定性就是由于分子浓度或者增加结构不均匀导致，而在溶液中金属纳米颗粒和拉曼分子都是均匀分布的，且很多生物活性物质在溶液中才能保证其活性不变，因此液相拉曼检测对于很多物质的分析和鉴别具有重要意义。然而，目前用市面上常用的耦合正置激光共聚焦显微镜的拉曼光谱仪来检测溶液样品，所得到的拉曼光谱强度也是忽高忽低，很不精确。在实验过程中我们发现，造成这一现象的原因主要是激光聚焦点选取不当:当选取溶液表面或者溶液与容器底部接触面作为聚焦点，因纳米颗粒会在液体表面形成膜状漂浮团聚体，在容器底部也会不可避免的存在一些团聚体受重力作用沉降下来，从而造成聚焦点测得拉曼光谱局部增强，而在其他地方强度较低；当选择溶液中心作为聚焦点，在检测过程中大家都忽视了检测光程对结果造成的影响，激光在检测溶液中光程不同，进而光程内被激发的拉曼分子数量不同，最终导致拉曼信号强度不稳定。
【发明内容】
[0004]技术问题:本发明所要解决的技术问题是:提供一种高稳定性的表面增强拉曼光谱的液相检测装置，该检测装置可以定量的检测溶液样品的表面增强拉曼光谱，且拉曼光谱具有稳定性，满足样品无损、无需预处理、快速准确等检测需求；同时还提供检测方法，简单易操作，且检测准确。
[0005]技术方案:为解决上述技术问题，本发明实施例采用的技术方案是:
一方面，本实施例提供一种高稳定性的表面增强拉曼光谱的液相检测装置，该检测装置包括带有物镜的倒置激光共聚焦显微镜、拉曼光谱仪、用于盛放待测溶液的容器、聚焦基片和隔片，隔片中设有通孔；隔片置于容器中，聚焦基片位于隔片上方，且聚焦基片覆盖隔片的通孔;待测溶液完全浸没聚焦基片和隔片通孔;容器位于激光共聚焦显微镜的样品台上，物镜位于激光共聚焦显微镜的样品台下方;物镜镜头与隔片的通孔相对;拉曼光谱仪的光路与激光共聚焦显微镜的物镜的光路连接。
[0006]作为优选例，所述的容器为透明光学石英材质制成。
[0007]作为优选例，所述的聚焦基片为石英片或者硅片，且石英片的光滑面或者硅片的光滑面与隔片相对。
[0008]作为优选例，所述的隔片和聚焦基片完全浸没在待测溶液液面下方。
[0009]另一方面，本实施例提供一种高稳定性的表面增强拉曼光谱的液相检测方法，该检测方法包括:
第一步:连接检测装置:将隔片置于容器内侧底面上，然后将聚焦基片置于隔片上，且聚焦基片覆盖隔片的通孔;将激光共聚焦显微镜倒置;将容器置于激光共聚焦显微镜的样品台上，调整激光共聚焦显微镜的样品台，使容器位置正对位于激光共聚焦显微镜样品台下方的物镜，且物镜镜头与隔片的通孔相对;将拉曼光谱仪的光路与激光共聚焦显微镜的物镜的光路连接；
第二步:将待测溶液倒入容器中，待测溶液完全浸没聚焦基片和隔片的通孔，且待测溶液的液面位于聚焦基片上方；
第三步:开启激光共聚焦显微镜和拉曼光谱仪，拉曼光谱仪的激发光束通过共聚焦显微镜的物镜聚焦为光斑，调节聚焦平面将光斑映射在聚焦基片和待测溶液交界面处，激光光束和光斑所在范围内，激发出的拉曼散射信号通过激光共聚焦显微镜的物镜接收并传送到拉曼光谱仪中，拉曼光谱仪采集拉曼散射信号并绘制出拉曼光谱。
[0010]作为优选例，通过调节隔片的厚度对检测光程进行精确调节，检测光程为拉曼光谱仪发出的激光光束和光斑在待测溶液中所占范围。
[0011]有益效果:与现有技术相比，本发明实施例具有以下有益效果:
1.本发明实施例的液相检测装置及方法，无需将金属纳米颗粒利用各种费时费力的方法排列成均匀的阵列或单层膜，直接对溶液中颗粒和拉曼分子进行检测，无需特殊处理制样简单快速，由于颗粒和拉曼分子在溶液中自由分散、密度均匀，排除了颗粒不规则团聚的耦合作用对检测造成的误差，极大的提高了所测拉曼光谱的重复性。
[0012]2.本发明实施例的检测装置及方法，选取溶液中间界面(如图1中的P3 )作为激光光斑聚焦点，而非使用传统液相检测方法中选取的溶液上液面(如图1中的Pl)或者溶液与容器底接触面(如图1中的P2)作为聚焦点。在溶液上液面(如图1中的Pl)纳米颗粒会由于自组装作用形成微小的膜碎片漂浮在溶液上表面。容器底部接触面(如图1中的P2)因为沉降作用而积累了不均匀分散的纳米颗粒微小团簇。因此将激光光斑聚焦在溶液上液面或者容器底接触面这两个界面，获得的拉曼光谱稳定重复性非常差，不均匀分散的颗粒团聚体或组装体导致拉曼光谱强度忽高忽低。本实施例选取溶液中间界面作为激光聚焦点，有效避开团聚体和组装体，通过检测均匀分散的颗粒和拉曼分子复合物获得稳定的拉曼光谱。
[0013]3.本发明实施例的检测装置及方法中，隔片的厚度可调，从而调节激光在液体中的光程，通过使用不同厚度的隔片，所测得的拉曼光谱强度随着光程增加而线性增加。这是因为光程增加导致所被激发的颗粒和拉曼分子数量增加，从而获得了更强的拉曼散射信号。而传统液相拉曼检测方法是使用拉曼光谱仪结合正置激光共聚焦显微系统，对石英片上微小液滴或者石英毛细管中溶液进行测量，没有考虑到检测方法中光程对检测结果的影响，而且在这些方法中很难保证不同样品在检测时光程一致，导致检测中产生误差。考虑到光程能够极大影响所测得拉曼光谱的强度，本实施例的检测方法可以非常简单地通过调节隔片的厚度来调节和固定光程，有效排除传统方法中光程不确定对结果的误差，获得更加准确的拉曼光谱。
【附图说明】
[0014]图1为本