乙型肝炎病毒e抗原定量检测试剂盒及其制备与检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及体外诊断检测领域，特别是涉及一种用于时间分辨免疫荧光分析法定量检测乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的试剂盒。
【背景技术】
[0002]近年来，临床上应用较多的乙型肝炎病毒e抗原检测方法主要有酶联免疫分析法(Enzyme Immunoassay, EIA)、化学发光免疫分析法(Chemilumineseent Immunoassay,CLIA)和时间分辨免疫突光分析法(Time-resolved Immunofluorometric Assay,TRFIMA)。
[0003]EIA的优点在于其无污染、操作简单、试剂有效期长、特异性好等，但由于其敏感性相对较低、测定范围相对较窄等缺点，限制了其在微量免疫定量分析中的应用。
[0004]CLIA的优点在于其敏感性高、测定范围宽，但由于大多数板式CLIA试剂盒仍采用EIA相同的酶促反应，以辣根酶或碱性磷酸酶交联抗体，使用鲁米诺或金刚烷等作为底物，检测的是动态发光，导致检测信号值衰减较快、高浓度和低浓度信号衰减速度不一致，限制了其在免疫定量分析中的低端检测灵敏度、稳定性和重复性。
[0005]TRFIMA应用镧系元素作为示踪剂，标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检出波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异性荧光的干扰，极大的提高灵敏度，具有特异性强、稳定性好、精密度高、可测定范围宽、试剂有效期长、操作简单、检测自动化程度高、数据自动生成处理能力强、无环境污染等优点。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题之一是提供一种乙型肝炎病毒e抗原检测试剂盒，它检测灵敏度高、特异性好、操作简单、无污染。
[0007]为解决上述技术问题，本发明的乙型肝炎病毒e抗原检测试剂盒，包括乙型肝炎e抗原校准品、抗-HBe单克隆抗体包被板、铕标记抗-HBe单克隆抗体、分析缓冲液、荧光增强液和浓缩洗液。
[0008]本发明要解决的技术问题之二是提供上述试剂盒的利记博彩app，该方法包括以下步骤:
[0009]I)制备乙型肝炎e抗原校准品:用PEI HBeAg82参考品配制的线性系列标定阳性血衆制备的HBeAg企业标准品,然后用经过标定的HBeAg企业标准品标定HBeAg重组抗原，稀释，得到不同浓度的HBeAg校准品；
[0010]2)制作抗-HBe单克隆包被板:将抗-HBe单克隆抗体稀释后加入到微孔反应板内，包被过夜，洗涤，封闭，干燥，将微孔反应板真空密封冷藏；
[0011]3)制备铕标记抗-HBe单克隆抗体:将两种抗-HBe单克隆抗体透析后，分别与DTTA-Eu以3:1和5:1的比例混合，静置22?24小时，分离DTTA-Eu和Ab_Eu，再经过疏水柱去除多聚体，获得铕标记抗-HBe单克隆抗体；
[0012]4)配制荧光增强液:用无水乙醇溶解β -ΝΤΑ、Τ0Ρ0,再加入邻苯二甲酸氢钾和三蒸水，40°C溶解后，加入乙酸、Ttiton X-100，调pH值至3.2，定容。
[0013]本发明要解决的技术问题之三是提供应用上述试剂盒定量检测乙型肝炎病毒e抗原的方法，步骤包括:
[0014]I)将乙型肝炎e抗原校准品及待测样本加入到抗-HBe单克隆包被板的微孔内，样本中的HBeAg抗原与包被在微孔上的抗-HBe单克隆抗体结合成抗-HBe-HBeAg复合物；
[0015]2)洗涤，加入铕标记抗-HBe单克隆抗体，与所述抗-HBe-HBeAg复合物形成抗-HBe-HBeAg-抗-HBe-DTTA-Eu 免疫复合物；
[0016]3)洗涤除去游离的铕标记抗-HBe单克隆抗体，加入荧光增强液，将复合物上的Eu3+解离到溶液中，并与荧光增强液中的有效成份形成高荧光强度的螯合物，检测该螯合物的荧光强度，得到样本中HBeAg的浓度值。
[0017]本发明的乙型肝炎病毒e抗原检测试剂盒，具有以下优点和有益效果:
[0018]1.可以定量测定人血清/血浆中的HBeAg含量，且检测灵敏度高(最低检测量不高于0.1PEI U/ml)、特异性好，从而可以为临床上乙肝个体化管理治疗方案提供更精确的参考。
[0019]2.操作简单，无污染。
[0020]3.成本低。本发明的试剂盒的检测灵敏度和进口发光试剂相似，但成本却远低于进口发光试剂。
[0021]4.采用PEI U/ml单位，与国际接轨，利于推广。
【附图说明】
[0022]图1是螯合物的荧光强度和HBeAg抗原浓度相关性曲线。
【具体实施方式】
[0023]本发明的乙型肝炎病毒e抗原检测试剂盒，由乙型肝炎e抗原校准品、抗-HBe单克隆抗体包被板、铕标记抗-HBe单克隆抗体、分析缓冲液、荧光增强液和浓缩洗液组成，其具体利记博彩app如下:
[0024]1.乙型肝炎e抗原校准品的制备
[0025]采用德国Paul-Ehrlich-1nstitut机构制备的PEI HBeAg82参考品配制的线性系列(浓度为0、0.1、1.5、15、75、100PEI U/ml)来标定阳性血浆制备的HBeAg企业标准品，使用经标化的HBeAg企业标准品标定HBeAg重组抗原，然后稀释成0、0.1、1.5、15、75、150PEIU/ml的HBeAg校准品。
[0026]2.抗-HBe单克隆包被板的制作
[0027]将三种抗-HBe单克隆抗体(生产厂家分别为日本特免、上海必吉和北京中科京达公司)以3:5:3的比例，用0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释至5_20 μ g/mL后加入微孔反应板内，100 μ L/孔，包被过夜后，经洗涤、封闭、干燥等程序，将微孔板条真空密封于铝箔袋内，冷藏备用。
[0028]3.铕标记抗-HBe单克隆抗体(抗-HBe-DTTA-Eu)的制备
[0029]将两种抗-HBe单克隆抗体(生产厂家分别为日本特免和厦门波生公司)经0.05mol/L的碳酸盐缓冲液透析后，分别与DTTA-Eu以3:1和5:1的比例混合，静置22-24小时后，经Sephracry S-200分离柱分离DTTA-Eu和Ab-Eu (抗-HBe-DTTA-Eu),再经过填充苯基-琼脂糖凝胶CL-4B的疏水柱去除多聚体，获得铕标记的单克隆抗体。
[0030]4.荧光增强液的配制
[0031]用无水乙醇溶解β -NTA (β -萘甲酰三氟丙酮)、Τ0Ρ0 (三辛基氧膦)，再加入邻苯二甲酸氢钾和三蒸水，40°C溶解后，加入乙酸、Ttiton X-100，调pH值至3.2，定容。
[0032]采用双抗体夹心时间分辨免疫荧光分析法(TRIFMA法)，使用上述乙型肝炎病毒e抗原检测试剂盒，定量检测样本中乙型肝炎病毒e抗原浓度的方法如下:
[0033]将乙型肝炎e抗原校准品及待测样本加入到抗-HBe单克隆包被板的微孔内，样本中的HBeAg抗原与包被在微孔上的抗-HBe单克隆抗体结合成抗-HBe-HBeAg复合物。洗涤后，再加入铕标记抗-HBe单克隆抗体(抗-HBe-DTTA-Eu)，抗-HBe-DTTA-Eu与结合在板上的HBeAg抗原反应，在微孔内形成免疫复合物抗-HBe-HBeAg-抗-HBe-DTTA-Eu。洗涤除去游离的铕标记抗-HBe单克隆抗体。加入荧光增强液，将复合物上的Eu3+解离到溶液中，并与荧光增强液中的有效成份形成高荧光强度的螯合物，其荧光强度和样品中的HBeAg抗原浓度成正比。测量该螯合物的荧光强度，通过图1的剂量一反应曲线得出样本中HBeAg的浓度值。
【主权项】
1.乙型肝炎病毒e抗原检测试剂盒，其特征在于:包括乙型肝炎e抗原校准品、抗-HBe单克隆抗体包被板、铕标记抗-HBe单克隆抗体、分析缓冲液、荧光增强液和浓缩洗液。2.权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤包括: 1)制备乙型肝炎e抗原校准品:用PEIHBeAg 82参考品配制的线性系列标定阳性血衆制备的HBeAg企业标准品,然后用经过标定的HBeAg企业标准品标定HBeAg重组抗原,稀释，得到不同浓度的HBeAg校准品； 2)制作抗-HBe单克隆包被板:将抗-HBe单克隆抗体稀释后加入到微孔反应板内，包被过夜，洗涤，封闭，干燥，将微孔反应板真空密封冷藏； 3)制备铕标记抗-HBe单克隆抗体:将两种抗-HBe单克隆抗体透析后，分别与DTTA-Eu以3:1和5:1的比例混合，静置22?24小时，分离DTTA-Eu和Ab_Eu，再经过疏水柱去除多聚体，获得铕标记抗-HBe单克隆抗体； 4)配制荧光增强液:用无水乙醇溶解β_ΝΤΑ、ΤΟΡΟ，再加入邻苯二甲酸氢钾和三蒸水，40°C溶解后，加入乙酸、Ttiton X-100，调pH值至3.2，定容。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)，将三种抗-HBe单克隆抗体按3:5:3的比例混合后，用0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释至5?20 μ g/mL,然后按100 μ L/孔加入到微孔反应板内。4.应用权利要求1所述试剂盒定量检测乙型肝炎病毒e抗原的方法，其特征在于，步骤包括: 1)将乙型肝炎e抗原校准品及待测样本加入到抗-HBe单克隆包被板的微孔内，样本中的HBeAg抗原与包被在微孔上的抗-HBe单克隆抗体结合成抗-HBe-HBeAg复合物； 2)洗涤，加入铕标记抗-HBe单克隆抗体，与所述抗-HBe-HBeAg复合物形成抗-HBe-HBeAg-抗-HBe-DTTA-Eu 免疫复合物； 3)洗涤除去游离的铕标记抗-HBe单克隆抗体，加入荧光增强液，将复合物上的Eu3+解离到溶液中，并与荧光增强液中的有效成份形成高荧光强度的螯合物，检测该螯合物的荧光强度，得到样本中HBeAg的浓度值。
【专利摘要】本发明公开了一种乙型肝炎病毒e抗原检测试剂盒，包括有乙型肝炎e抗原校准品、抗-HBe单克隆抗体包被板、铕标记抗-HBe单克隆抗体、分析缓冲液、荧光增强液和浓缩洗液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法，以及应用该试剂盒检测乙型肝炎病毒e抗原的方法。该试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好、操作简单、无污染、成本低的优点，可用于定量检测人血清/血浆中的HBeAg含量，为临床乙肝个体化管理治疗方案提供更精确的参考。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105572358
【申请号】CN201410525393
【发明人】于春红, 李楠, 曹真, 黄加喜, 任媛媛
【申请人】苏州新波生物技术有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月9日