快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试 纸条、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 辣椒素类化合物是使辣椒具有辛辣刺激的主要化学物质，其成分主要包括辣椒 素、二氢辣椒素、高二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高辣椒素等化合物。其中辣椒素和二氢辣椒 素约占辣椒素类物质总量的90%，并提供了约90%的辣热感刺激。除了赋予食品辛辣味被 用作调味品以外，辣椒素类物质还具有消炎镇痛、抗病菌、抗肿瘤作用，能促进脂肪燃烧、降 低血脂，抑制胃酸分泌、对胃黏膜损伤有保护作用等药用价值。在食品加工领域，辣椒素类 物质因其辛辣特性及特有的营养价值，被广泛应用于日常饮食当中。然而，辣椒素类物质也 被证明是一种生物毒素，过多食用辣椒素类物质会引起动物身体不适，甚至产生休克现象。 因此，检测食品中辣椒素类物质的成分含量对于指导辣味食品的安全生产及标准化管理具 有重要意义。
[0003] 现有的对辣椒素类物质的检测方法主要是精密仪器分析法，包括高效液相色谱 法、气相色谱与质谱联用法、液相色谱与质谱及串联质谱联用的方法，其灵敏度高，准确性 好，但仪器昂贵，要求所检测的样品的纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环 境和检测人员要求高，难以实现快速检测，检测成本高，不适用于现场快速检测。免疫分析 方法由于其特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染 危害小、适于现场批量检测等优点在近年来获得了快速发展。基于胶体金标记抗体与抗原 特异性结合反应的免疫层析技术由于其检测结果肉眼可见，不需要大型仪器设备，检测成 本低，分析时间短，近年来在真菌毒素、农药残留等微量残留物的定性、在线、快速检测上得 到了广泛应用。然而，目前国内外还未有将该方法应用于辣椒素类物质的检测中。由于我国 的饮食习惯，辣椒食品丰富，但其产品说明中的辣味程度标示模糊，因此迫切需要能快速、 准确、现场检测辣椒素类物质的技术，以实现对辣味食品中辣椒素类物质的统一的、规范化 的生产。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的问题是提供快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条、 制备方法及其应用。该免疫层析试纸条可用于食品中辣椒素类物质的快速检测，具有操作 简单、成本低廉、灵敏度高的特点。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0006] 快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条(见图1)，包括纸板，纸板的一面 从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检 测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的 质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述的检测线上包被辣椒素类物质包被抗原;所述金标 垫横向喷涂有纳米金标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体;所述抗辣 椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC N0.C201534的杂交瘤 细胞株YQQD8分泌产生。
[0007] 按上述方案，所述的吸水垫长16~18mm，宽3~4謹，检测垫长23~30謹，宽3~4mm; 金标垫长6~12mm，宽3~4mm;样品垫长12~15mm，宽3~4mm，相邻各垫的交叠长度为1~ 3mm 〇
[0008] 按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。
[0009] 按上述方案，所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为8~15mm，所述 检测线与质控线的间距为5~10mm。
[0010] 按上述方案，所述的辣椒素类物质包被抗原的分子结构式如式Π 所示：
[0011] 按上述方案，所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白0VA或钥孔血蓝蛋白 KLH，优选为卵清白蛋白0VA。
[0012] 按上述方案，所述检测垫检测线上每厘米所需要的辣椒素类物质包被抗原的包被 量为0.125~0.6yg;质控线上每厘米所需要的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1~0.6yg。 [00 13]按上述方案，所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15~20nm;所述金标垫上每厘 米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的用量为400~980ng。
[0014] 如上所述快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下 步骤：
[0015] (1)吸水垫的制备
[0016] 将吸水纸剪裁即得吸水垫；
[0017] (2)检测垫的制备
[0018] 检测线的包被:将辣椒素类物质包被抗原配制成浓度为0.2~1.2mg/mL的包被液， 于距硝酸纤维素膜上沿8~15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到 检测线，每厘米检测线所需辣椒素类物质包被抗原的包被量为0.125~0.6yg，然后于37°C 条件下干燥30~60分钟；
[0019] 质控线的包被:将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.15~1.2mg/mL的包被液，于距 检测线5~10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质 控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1~〇.6yg，然后于37°C条件下干燥30~60分 钟；
[0020] (3)样品垫的制备
[00211将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37~40°C条件下干燥6~12小时，得样 品垫，然后置干燥器中室温保存；
[0022] (4)金标垫的制备
[0023] 将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37~40°C条件下干燥6~12小时，于已 干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗辣椒 素类物质通用单克隆抗体溶液，每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用 单克隆抗体的用量为400~980ng，然后真空冷冻干燥2~6小时，置干燥器中室温保存;所述 抗辣椒素类物质通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC N0.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分 泌产生。
[0024] (5)试纸条的组装
[0025]在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连 接处交叠连接，交叠长度为1~3mm，即得快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条。 [0026]按上述方案，辣椒素类物质包被抗原的包被液中所使用的包被缓冲液为:每1 OmL 中含有卵清蛋白OVA 0. lg，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化 钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g;
[0027 ]所述的兔抗鼠多克隆抗体的包被液中所使用的包被缓冲液为:每1 OmL中含有牛血 清白蛋白〇. lg，叠氮化钠〇. 〇〇2g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g， 磷酸二氢钾〇.〇〇2g;
[0028] 按上述方案，所述步骤(3)和步骤(4)中的封闭液每1 OOmL中含有:卵清白蛋白1~ 2g，鹿糖2~5g，叠氮化钠0.02~0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾 0.02g，磷酸二氢钾 0.02g。
[0029] 按上述方案，所述纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体溶液是采用不饱 和标记法制备的，其具体方法为：取50 . OmL市售质量浓度为0.01 %的纳米金溶液，用 0.4mL0. lmol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL 0. lmg/mL的抗辣 椒素类物质通用单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min;加入质量浓度为10%卵清白蛋白 (0VA)水溶液至0VA终质量浓度为1%，继续搅拌30min;于4°C放置2h后，3000r/min离心 15min，取上清液，弃沉淀;将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0 mL标记洗 涤保存液;再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到 5. OmL浓缩物，置4°C冰箱备用。
[0030] 按上述方案，所述的0. lmol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至 1000mL，0.22μπι滤膜过滤所得;所述的标记洗涤保存液为:2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮 钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μπι滤膜过滤所得。
[0031 ]如上所述的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的应用，方法如下： [0032]称取已磨细待测样品，加入体积浓度为95%的乙醇水溶液，混匀，在60~90°C下回 流1小时，冷却后，将提取液真空旋转干燥，加入10%甲醇-PBS溶液复溶，得到待测样品溶 液，再取80-200yL该待测样品溶液作为检