一种百合李属坏死环斑病毒半定量检测金标卡及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种对百合病毒快速半定量检测的金标卡及制备方法，具体指运用胶体金免疫层析法研制出能快速半定量检测侵染百合的李属坏死环斑病毒(PNRSV)的金标卡及其制备方法。
【背景技术】
[0002]百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生宿根单子叶草本植物，是世界著名的球根花卉，栽培历史悠久，集观赏、食用和药用于一体;荷兰作为世界上最大的花卉种植大国，其百合的切花及种球产业发展较为成熟;在中国，食用和药用百合产业发展较好，主要产区在甘肃、湖南和湖北，主要品种为兰州百合、龙牙百合(野百合)等；对于切花百合，近年来，随着我国观赏百合种植面积的迅速增加，从国外引进种球的数量和批次数目不断增长，影响百合生产的病毒病在各百合种植区普遍流行。
[0003]目前文献报道侵染百合的病毒有20多种，除百合斑驳病毒(Lilymottle virus,LMoV)，黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)和百合隐症病毒(Lily symptomlessvirus, LSV)外，李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)也被证实可侵染百合;韩丽娟等(2008)对来自荷兰的进口百合样品和来自中国的田间百合样品进行了病毒检测，发现28个样品中，有8个样品检测到PNRSV的侵染，侵染率达28.6%。
[0004]PNRSV是一种在世界范围内广泛发生的病毒病原物，能够侵染危害多种核果类果树(如桃、楼桃、李、杏和油桃)和一些观赏植物(如玫瑰和百合)，被列为《中华人民共和国进境植物检疫危害性病、虫、杂草名录》中二类危险性有害生物;PNRSV能够侵染47个属的189种植物；目前，该病的发生已遍及欧洲、亚洲、非洲、南美和北美洲及大洋洲的40多个国家和地区；PNRSV属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)；PNRSV是正单链的RNA病毒，核酸大小为8.056kb;PNRSV病毒粒子形态为等轴对称多面体，直径约为22-23nm，沉降系数为79?119 S，粒子的分子量为5.2-7.3 X 16，A260/280为1.56，RNA约占粒体重量的16%; CP蛋白含一种亚基，分子量约为25.0kDa。
[0005]关于PNRSV的检测研究，目前有酶联免疫法(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)等的相关报道，以上方法都还停留在研究和实验室阶段，无法满足百合种植现场及田间快速检测的需求，从而无法掌握田间病毒感染的准确信息。此外，这两种传统实验室检测方法都需要专业人员用专门的仪器设备在实验室花很长时间才能完成，其程序复杂，检测费用高、对仪器设备和检测条件要求高，因此使用范围受到很大的局限。
[0006]胶体金免疫层析方法利用抗原抗体的结合，以及胶体金呈现颜色反应来检测抗原或抗体;该方法可以避免以上几种检测方法的缺点，以其特异性强、成本低、操作简便、适合现场快速检测等优点已被广泛接受，已用于包括烟草斑驳病毒、南瓜花叶病毒等多种植物病毒的检测。对于百合病毒，目前虽有用胶体金免疫层析法检测LMoV和LSV等的相关报道(Zhang et al., 2015, J Virol Methods , 220)，但是其只能进行定性检测，也就是说检测结果仅能定性判断病毒的有或无，对于阳性结果无法得知被检样品病毒含量的差异，田间防治病毒时依旧盲目而缺乏科学依据，从而阻碍了该方法的广泛普及与推广。
[0007]近年来，通过我们对田间感病毒程度不同的百合叶片叶绿体超微结构、光合色素含量、防御酶活性等生理生化指标的测定和分析，发现许多阳性植株通常无明显症状，其叶绿体结构、光合色素含量以及株高、茎粗、叶片形状等生长指标与健康植株没有差异;而部分阳性植株叶片形成了轻微的斑驳条纹，叶绿体结构被部分破坏，光合色素含量以及株高、茎粗等生长指标显著低于健康植株;也发现少量的阳性植株出现了明显的斑驳条纹或坏死斑，叶片严重变小，植株严重矮化，生理测定发现其叶绿体结构被严重破坏，光合色素含量显著低于健康植株(Zhang et al., 2014, Philipp Agric Scientist, 97(1));进一步通过对病毒含量的Real-time PCR检测，证实出现严重症状的阳性植株，其病毒相对含量是无症状阳性植株的 1000倍以上(Zhang et al., 2014, Philipp Agric Scientist, 97(2));以上实验结果说明病毒含量的差异对百合生长影响的差异较大，所以对于感病程度不同的阳性植株应该采取不同的策略，科学管理、合理防治，最大程度降低病毒对百合生长的危害;可见，检测病毒含量的差异将对田间病毒管理起到非常重要的指导意义。
[0008]此外，目前对于百合病毒的防治主要以杀灭传播介体-蚜虫为主，对于如何科学地喷施抗百合病毒药剂，喷施抗病毒药剂后百合病毒增殖是否被抑制，若已抑制，抑制的程度如何等问题均没有相关报道，而这些问题的解决首先依赖于半定量检测；因此，实现半定量检测的意义重大。
[0009]本发明为了进一步提高胶体金免疫层析检测方法的使用效率和田间普及率，实现对百合病毒的快速且半定量检测，通过一系列优化试验，将半定量检测应用于胶体金免疫层析试验，首先将检测线增加至三条，再将已知量的有浓度差异的抗体分别包被于检测线，研制能快速半定量检测PNRSV的金标卡，满足百合大规模脱毒及商业和田间对百合病毒快速半定量检测的需求。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于客服现有技术的不足，提供一种用胶体金免疫层析法半定量检测PNRSV的金标卡及其制备方法。
[0011 ]本发明金标卡检测准确率高，特异性强，重复性好，操作简便，无需借助其他仪器和设备，5?10分钟便可以判定被检样品PNRSV含量的差异。
[0012]本发明的技术方案如下:
一种半定量检测百合李属坏死环斑病毒的金标卡，包括:金标卡槽I，衬板12，样品垫8，胶体金结合垫9，硝酸纤维素膜10，吸水滤纸11，金标卡槽I包括上壳体和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有加样孔2和反应窗3，样品垫8置于加样孔2下方，硝酸纤维素膜10置于反应窗3下方，胶体金结合垫9上含有金标探针，衬板12固定于金标卡槽I中，样品垫8、胶体金结合垫9、硝酸纤维素膜10和吸水滤纸11依次排列连接于衬板12上表面，硝酸纤维素膜10上设有第一检测线4、第二检测线5、第三检测线6和对照线7，第一检测线4、第二检测线5、第三检测线6上分别包被的是不同浓度的兔抗PNRSV I gG，对照线7上包被的是羊抗兔IgG，第一检测线4、第二检测线5、第三检测线6上PNRSV IgG包被量分别为2.0?2.5pg、1.0?1.25 yg和2.0?2.5 yg蛋白，金标探针抗体标记量为20yg/mL，羊抗兔IgG包被量为2.0?2.5yg蛋白。
[0013]其中在用所述金标卡检测时，在所述加样孔处加入百合样品的待检溶液，对比反应窗内检测线4