一种利用抗体修饰免疫pcr反应的检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学检测方法领域，具体涉及一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检 测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] ELISA检测技术从其发明之日起就在临床和科研市场中得到越来越广泛的应 用(Lequin, R. Μ. (2005). Enzyme Immunoassay(EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA). Clinical Chemistry 51,2415 - 2418·)。随着越来越精细的检测需求，终端 用户在体外诊断的灵敏度、动态范围和多通道检测能力等方面有了越来越高的要求。基于 抗体检测的技术也越来越多样化，出现了很多新技术。根据技术路线和需求的不同分为以 下几类：
[0003] 1.灵敏度的提升。经过多年的技术升级和成熟，目前ELISA技术的灵敏度已经达 到极限。现有的尝试也都是基于检测方法的改进来提升灵敏度，比如采用创新型微孔板技 术的 Siloam Biosciences 公司（ http://siloambio.com/)和应用微珠技术的 Quanterix 公司（http://www.quanterix.com/)。
[0004] 2.多通道检测。Luminex公司发明的像xMAP Multiplexing技术理论上可以最 多支持 500 种分析物的同时检测（http://www. luminexcorp. com/TechnologiesScience/ xMAPTechnology/)。这种技术也是利用barcode的微珠标记上不同抗体来检测样本中的多 种分析物。实际开发中可以达到20种左右的生物标志物同时检测。
[0005] 3.液相 ELISA 技术（Bidinosti，M.，Shimshek，D. R.，Mol lenhauer，B.，Marcell in, D. , Schweizer, T. , Lotz, G. P. , Schlossmacher, M. G. , and Weiss, A. (2012). Novel one-step immunoassays to quantify ?-synuclein:applications for biomarker development and high-throughput screening. J. Biol. Chem. 287, 33691 - 33705.)〇
[0006] 将检测抗原的两种单抗分别标记不同的微珠或者荧光基团，利用抗体和抗原结合 时将两种不同的微珠靠近或者荧光基团发生共振能量转移（FRET)可以实现被检标志物的 液相检测。这种检测方法不再需要多步清洗而直接检测，减少了检测时间和自动化的难度。
[0007] 4. ELISA 技术微型化（Ng, A. H. C.，Uddayasankar, U.，and Wheeler, A. R. (2010) · Immunoassays in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem 397,991 - 1007.)〇 很多石开 究将ELISA微型化至微流体芯片上从而实现ELISA实验的微型化和便携性。
[0008] 上述ELISA的改进都是在现有原理的基础上进行优化，因此也很难带来本质性 的性能提升。Immuno-PCR的工作原理如图1所示。Immuno-PCR(免疫PCR)技术自1992 年 Sano 等人发明以来（Sano, T.，Smith, C. L.，and Cantor, C. R. (1992). Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science 258, 120 - 122.)，曾经一度被认为是可以像PCR -样检测蛋白质的技术，可惜受制于抗体 修饰技术而一直未能获得商业上的成功。多年来抗体修饰一直依赖于间接修饰技术和直接 化学修饰技术。前一种技术利用生物素 Biotin随机修饰抗体表面，然后在通过链亲和素 (Streptavidin)将Biotin修饰的DNA和抗体以非共价键的方式稱联。后一种是通过将抗 体或者DNA活化之后与DNA或者抗体上的自由氨基反应达到共价耦联。不过不论哪种方法 都是通过抗体上自由的氨基（比如Lysine)来实现的。这种耦联技术不但需要抗体在非活 性的缓冲液中进行耦联，而且耦联的位点也充满随机性，常常由于抗原抗体结合区附近被 奉禹联的DNA屏蔽从而导致了抗体特异性和亲和力的下降。这也是Immuno-PCR这么多年来在 实例中灵敏度难以突破1000倍而且提升程度不一的原因。因此，科研和生产中均需要一种 利用抗体修饰技术应用于Immuno-PCR反应的、灵敏度大大提高的检测试剂盒和检测方法。
【发明内容】
[0009] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用抗体修饰免疫PCR反应的 检测试剂盒及检测方法，该方法通过抗体修饰技术在免疫PCR反应中的应用，可以进行超 低浓度生物素标志物的检测。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0011] 一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测试剂盒，包括：带DIB0标记的核酸修饰的检 测抗体、包被有带DIB0标记的生物素修饰的捕捉抗体的Immuno-PCR微孔板、用于扩增核酸 的引物对、荧光定量染料混合体系。
[0012] 进一步地，所述核酸为ssDNA;该ssDNA的DNA序列包括SEQ ID No. 1，用于扩增该 ssDNA的引物对的DNA序列包括SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3。
[0013] 进一步地，所述荧光定量染料混合体系包括：耐热聚合酶反应缓冲液、镁离子、 dNTP、参考染料、PCR扩增用DNA聚合酶、DNA结合染料。
[0014] 本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
[0015] -种利用抗体修饰免疫PCR反应检测方法，包括如下步骤：
[0016] DIB0标记ssDNA的合成步骤：先通过DNA序列随机合成网站生产ssDNA序列（SEQ ID No. 1)，再合成带DIB0标记的ssDNA ;
[0017] 捕捉抗体的生物素修饰步骤：将捕捉抗体利用带DIB0标记的生物素进行生物素 修饰，得到带DIB0标记的生物素修饰的捕捉抗体；
[0018] 检测抗体的ssDNA修饰步骤：将检测抗体利用所述带DIB0标记的ssDNA进行 ssDNA修饰，得到带DIB0标记的ssNDA修饰的检测抗体；
[0019] Immuno-PCR微孔板的制备步骤：用所述带DIB0标记的生物素修饰的捕捉抗体包 被链亲和素 PCR微孔板，再将该微孔板经过孵育、清洗，得到Immuno-PCR微孔板；
[0020] 待测样品的Immuno-PCR定量步骤：
[0021] 将待测样品和所述带DIB0标记的ssNDA修饰的检测抗体混合之后，加入所述 Immuno-PCR微孔板中；再经过孵育、清洗，加入能够特异扩增ssDNA的引物对（SEQ ID No. 2 和3)进行荧光定量PCR反应，再完成ssDNA的PCR定量。
[0022] 进一步地，所述捕捉抗体为Insulin单克隆抗体3A6,所述检测抗体为Insulin单 克隆抗体8E2,所述待测样品为Insulin。
[0023] 进一步地，所述捕捉抗体的生物素修饰步骤中，先将捕捉抗体进行第一轮纯化处 理，再加入修饰酶进行修饰反应，再进行第二轮纯化处理，得到第二轮纯化后的捕捉抗体； 再将所述第二轮纯化后的捕捉抗体与于DIB0标记的生物素进行生物素标记反应，再进行 亲和纯化处理，得到所述带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体。
[0024] 进一步地，所述检测抗体的ssDNA修饰步骤中，先将检测抗体进行第一轮纯化处 理，再加入修饰酶进行修饰反应，再进行第二轮纯化处理，得到第二轮纯化后的检测抗体； 再将所述第二轮纯化后的检测抗体与于DIB0标记的ssDNA进行ssDNA标记反应，再进行亲 和纯化处理，得到所述带DIB0标记的ssDNA修饰的检测抗体。
[0025] 进一步地，所述待测样品的Immuno-PCR定量步骤中，所述突光定量PCR反应的条 件是：95°C 10分钟；95°C 15秒，60°C 60秒，共40个循环。
[0026] 本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
[0027] 一种用于标记抗体的ssDNA，其DNA序列包括SEQ ID No. 1。
[0028] 本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
[0029] 一种用于扩增ssDNA的PRC引物对，其序列包括SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3。
[0030] 本发明的Immuno-PCR检测方法的工作原理图如图1所示。
[0031] 本发明的Immuno-PCR试剂盒的制备、使用流程图如图2所示。
[0032] 本发明相比现有技术具有以下有益效果：
[0033] 本发明公开了一种超高灵敏度免疫诊断方法及其应用，属于临床诊断试剂开发领 域。
[0034] 1、本发明用于科研和临床诊断，食品安全，农残检测等市场。超过传统ELISA方法 1000倍的灵敏度可以允许检测浓度极低的生物标志物，农药残留。或者可以对已有的样本 进行100-1000倍稀释之后再进行检测，从而极大程度地节省珍贵的样本，比如小儿血清或 者临床PKPD (药代动力学）研究中的珍贵血清。
[0035] 2、本发明不但可以用于Insulin的检测，而且可以适用于所有生物大分子，半抗 原，以及化学小分子的检测。检测形式不但可以适用于夹心法ELISA，还可以应用于直接 ELISA和竞争ELISA法。酶学方法修饰抗体属于位点特异性修饰反应，有别于传统氨基耦联 方法产生的非均一性，随机位点修饰。随机修饰会经常屏蔽抗原抗体结合区，改变抗体亲和 力和特异性。定量PCR检测方法的引入不但可以简化检测流程，还可以提供更加宽广的动 态范围和检测灵敏度。Insulin的实例研究表明动态范围可以提升至至少7个数量级，检测 灵敏度可以比传统ELISA提高10000倍左右。
[0036] 3、本发明采用最新的一种酶学修饰抗体的方法（Boeggeman, E.，Ramakrishnan, B. ,Pasek, Μ. , Manzoni, Μ. , Puri, A. , Loomi