一种用于鉴别四倍体大燕麦、普通小麦或其杂交后代染色体数的制片方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物染色体的制片方法，特别涉及一种有效鉴别四倍体大燕麦、 普通小麦或其杂交后代染色体数的制片方法，本发明属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]四倍体大燕麦(Avena magna L.)是一个野生种，系异源四倍体，表现为对小麦白 粉病、锈病、赤霉病高抗或免疫，以及具有早熟、抗旱，蛋白质(42% )、赖氨酸含量高等特点 (孙泽民等.中国燕麦.北京：中国农业出版社，1989;余懋群等.3种燕麦的核型研究.武汉植 物学研究，1995,13(2):177-179;邓光兵等.燕麦种间杂种?:的形态学与细胞遗传学研究. 作物学报，2005，31 (9): 1186-1191.)。为了使四倍体大燕麦的这些优良性状转移到普通小 麦(Triticum aestivum L·)，最近十多年来，本课题组开展了一系列四倍体大燕麦与普通 小麦的杂交和选育工作，获得了一批品质好的、稳定的杂交品系。有效了解这些杂交后代的 染色体组成对于认识其杂交和染色体重组机制具有重要的作用。
[0003] 植物染色体的制备有上百年的历史，使用的部位包括根尖、腋芽、茎尖、愈伤组织 等生长旺盛的区域。小麦为世界范围内重要的粮食作物，因此人们很早就关注其染色体组 成并做了大量的观察分析，流程大体如下（陈瑞阳等:植物有丝分裂染色体标本制备新方 法.植物学报，1979，21 (3): 297-298;李懋学，张教方.植物染色体研究技术.哈尔滨:东北林 业大学出版社.）：
[0004] 1.预处理:应用适宜的预处理液(如饱和的α-溴代奈、对苯二酚、一定浓度的8-羟 基喹啉或秋水仙素溶液)或低温等。
[0005] 2.低渗:通常用蒸馏水或0.075Μ KC1室温处理30分钟。
[0006] 3.固定:最常用固定液为甲醇:冰醋酸(体积比3:1)。
[0007] 4.解离:一种是酸解，酸解液为1Ν的浓盐酸或浓盐酸:95%乙醇(体积比1:1); 一种 是酶解，即一定浓度的纤维素酶和果胶酶混合液。
[0008] 5.后固定:解离后的材料水洗后用上述固定液固定。
[0009] 6.制片:大多采用压片法或火焰干燥法。
[0010] 7.染色:染色液有改良的苯酚品红、卡宝品红、孚尔根、吉姆萨等。
[0011]迄今国内有关燕麦染色体制备方面的报道很少，步骤也不很详细。武生辉等(武生 辉等.野生大燕麦和砂燕麦的核型研究.内蒙古农牧学院学报，1989,10(2) :115-120.)开展 野生大燕麦和砂燕麦染色体制备的流程为：
[0012] 预处理一〇·〇〇2Μ 8-羟基喹啉的0.01%-0.2%秋水仙素溶液，3小时；
[0013] 酸解一IN HC1，60°C下，5-8分钟；
[0014] 水洗--蒸馏水冲洗3-5次或冲洗卜2次后用水泡1小时；
[0015] 酶解一2.5 %果胶酶和纤维素酶混合液，26°C，40分钟；
[0016] 染色一卡宝品红，5-20分钟。
[0017] 余懋群等（余懋群等.3种燕麦的核型研究.武汉植物学研究，1995,13(2):177-179.)提供的砂燕麦、野生大燕麦、黑龙江野燕麦核型分析的步骤很简单，即：取萌发种子的 根尖，在饱和α-溴代奈溶液0_4°C下预处理1夜后，用酒精、冰醋酸(3:1)固定液0_4°C下固定 24小时，用孚尔根染色观察。
[0018] 综上所述，到目前为止有关普通小麦和燕麦染色体制备的方法不外乎预处理、固 定、解离、后固定、制片和染色等程序。为了探讨四倍体大燕麦与普通小麦杂交后代染色体 的数目，我们最初也采用这种通用的技术处理根尖，然而结果并不理想，表现在：
[0019] 第一，采用研究者们普遍使用的饱和α-溴代奈室温预处理3小时或用蒸馏水4°C低 温过夜处理后，根尖细胞中的分裂相较少，染色体黏在一起，难以鉴别。而不经任何预处理 后直接低渗、固定，根尖细胞中的分裂相较多，但染色体分散差。
[0020] 第二，用蒸馏水或0.075M KC1室温前低渗处理30分钟达不到使染色体分散的效 果。
[0021] 第三，只用酶解或酸解难以使根尖有效软化、缺少后低渗、后固定的时间短于1小 时、压片力度不足等，这些都影响到细胞的分散和染色体的分开。
[0022] 因此，目前迫切需要提供一种可用于普通小麦和大燕麦染色体制备的方法，从而 为大燕麦与普通小麦的杂交和选育工作提供技术支持。
【发明内容】
[0023] 针对现有技术中存在的问题，考虑到这两个亲缘关系较近的物种杂交后会发生染 色体断裂、融合、易位等现象，从而导致细胞内染色体很粘稠，不易分开的特点，本发明人认 为:恰当的预处理是必要的，但浓度需要调整;前低渗的时间需要延长;酶解和酸解应该合 理结合从而保证植物材料能充分软化;增加后低渗以及后固定处理的时间。
[0024] 为此，本发明提出了一种用于鉴别四倍体大燕麦、普通小麦或其杂交后代染色体 数的制片方法，具体步骤如下：
[0025] (1)预处理:0·075mol/L KC1溶液、饱和α-溴代萘溶液和蒸馏水按照体积比2:3:5 配制成预处理液，将植物材料浸泡于预处理液中，22-25°C处理3小时后，水洗15分钟；
[0026] (2)固定：甲醇与冰醋酸按照体积比3:1配制成固定液，将预处理后的植物材料用 固定液固定，22-25°C固定1小时，水洗15分钟；
[0027] (3)酶解:2%纤维素酶和2%果胶酶按照体积比1:1配制成酶解液，将固定后的植 物材料用酶解液在37°C下酶解2小时，快速水洗，避免剧烈震荡；
[0028] (4)酸解:浓盐酸和95%乙醇按照体积比1:1配制成酸解液，将酶解后的植物材料 用酸解液22_25°C处理1分钟，水洗15分钟；
[0029] (5)后低渗:酸解后的植物材料置于0.075mol/L KC1溶液中，22-25°C处理1小时；
[0030] (6)后固定:经后低渗处理后的植物材料采用步骤(2)中的固定液22_25°C固定1小 时以上；
[0031] (7)制片:挑取2-3个经上述步骤处理后的植物材料，用玻棒用力砸碎后轻轻铺散 到整个载玻片，而后进行火焰干燥；
[0032] (8)染色；
[0033] (9)压片。
[0034] 在本发明中，优选的，所述的植物材料包括取自四倍体大燕麦、普通小麦或其杂交 后代的根尖或莖尖。
[0035] 在本发明中，优选的，所述的染色包括在载玻片上滴加改良苯酚品红，加上盖片， 22-25°C染色10分钟。
[0036] 采用本发明的方法，我们对四倍体大燕麦与普通小麦杂交后代22个品系的染色体 数目进行了分析，结果发现采用该方法得到的染色体制片中细胞分裂相多、染色体分散好， 而且该方法重复性高，结果可靠，因此，本发明提供了一种能够有效鉴别四倍体大燕麦、普 通小麦或其杂交后代染色体的数目新方法。
【附图说明】
[0037] 图1为采用常规制片方法观察到的细胞分裂相照片；
[0038] 图1A为杂交后代品种S20的细胞分裂相照片(X 200)，其中很难找到一个中期相； 图1B为杂交后代品种S109-3-5的细胞分裂相照片(X 200)，其中未见一个中期相；
[0039] 图2为采用常规制片方法观察到的染色体的分散情况；
[0040] 图2A为杂交后代品种S109-169的染色体的分散情况(X 1000)，其中大部分染色体 都绞在一起，难以数清；图2B