一种烟草及无烟气烟草制品中挥发性n-亚硝胺的gc-ms/ms分析测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺的分析技术领域，具体涉 及一种烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺的GC-MS/MS分析测定方法，是使用气相 色谱-串联质谱法（GC-MS/MS )分析烟草及无烟气烟草制品中N-亚硝基二甲胺（NDMA)、 N-亚硝基吡咯（NPYR)、N-亚硝基哌啶（NPIP)、N-亚硝基甲基乙基胺（NMEA)、N-亚硝基二乙 胺（NDEA)、N-亚硝基甲基丁基胺（NMBA)、N-亚硝基二丙胺（NDPA)、N-亚硝基吗啉（NM0R)、 N-亚硝基二丁胺（NDBA)等9种主要挥发性N-亚硝胺，利用该方法可定量分析烟草及无烟 气烟草制品中9种挥发性N-亚硝胺的含量。
【背景技术】
[0002] 挥发性N-亚硝胺是一类受到广泛关注的致癌类物质，是Hoffmann "43种有害成 分"清单和2012年美国食品药品监督管理局（FDA) "烟草制品及烟气中有害及潜在有害物 质名单"中的重要物质，是国际癌症研究机构（IARC) "无烟气烟草制品中28种有害物质" 名单中的重要成分。
[0003] 关于烟草及无烟气烟草制品样品前处理，目前主要参考1977年Brunnemann的方 法进行，即采用缓冲溶液进行提取，然后经过液液反萃取和固相萃取进行分离净化，使得样 品前处理操作繁琐，不利于大批量样品的分析测定。而针对烟草中挥发性N-亚硝胺的检 测，主要采用气相色谱-热能分析联用法（GC-TEA)，其是一种对亚硝胺和亚硝酸酯响应的 专一型检测器，具有灵敏度高等优点，GC-TEA是挥发性N-亚硝胺分析的主流方法，但是，该 分析方法存在分析时间长、检测效率低及出现假阳性等缺点。随着高选择性、高灵敏度的串 级质谱联用技术的发展，GC-MS/MS由于检测灵敏度高，通过基质配标消除基质效应，已被广 泛用于食品、化妆品中挥发性N-亚硝胺的分析，但在烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚 硝胺的分析尚未有相关研究。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种分离分析烟草及无烟气烟 草制品中挥发性N-亚硝胺的新方法，解决了现有技术中前处理所存在的不足，为准确评估 烟草及无烟气烟草烟草制品中挥发性N-亚硝胺的安全风险提供技术支撑。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 本发明的烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺的GC-MS/MS分析方法是将烟叶样 品磨碎成粉末状后(无烟气烟草制品直接称量)，准确称取，加入碱性二氯甲烷和内标溶液， 于振荡器上振荡，加入无水硫酸镁，手持振荡，然后加入N-丙基乙二胺（PSA)和石墨碳，再 次手持振荡混合均匀；然后振荡、离心，取上清液氮吹浓缩，最后用GC-MS/MS进行测定。具 体步骤如下： (1)样品萃取：将准确称取的4 g样品放于50 mL离心管中，加入4 mL氢氧化钠溶液 (0. 1 mol/L)手持振荡15 S，然后加入30 mL二氯甲烷和20 μL内标工作溶液，于振荡器中 振荡 20 min。所述内标(为混合内标）为 NDMA-D6、NMEA-D3、NDEA-D10、NDPA-D14、NM0R-D8、 NPYR-D8、NPIP-D8、NDBA-D8 的二氯甲烷溶液，浓度均为 20 ng/mL。其中 NDPA-D14 为 NMBA 和NDPA的内标。
[0006] (2)样品溶液净化：加入4 g无水硫酸镁除去水分，再加入1 g PSA和0. 5 g石墨 碳，进行样品溶液净化处理。
[0007] (3)振荡和离心：样品在振荡器上以280 rpm的速度振荡2 min，在高速离心机上 以10000 rpm的转速离心5 min。
[0008] (4)浓缩：离心后取上清液在45°C恒温水浴中氮吹浓缩至1 mL左右，将其转移至 2 mL色谱小瓶中，以备检测。
[0009] (5)GC-MS/MS测定：将标准溶液和样品溶液按照表1中GC-MS/MS仪器工作参数进 行测定，按照表2列出的定性离子进行物质确认和定量分析，依据浓度和峰面积进行校正 计算样品中亚硝胺残留量。
[0010] 所述标准溶液(为混合标准工作溶液）以二氯甲烷为溶剂，浓度为2 ng/mL、5 ng/ mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 和 200 ng/mL 的 VNAs 系列标准溶液，分别加 入内标，使各内标物的浓度均为20 ng/mL。
[0011] 表1 GC-MS/MS仪器工作参数
本发明的优点在于：首次将基质分散固相萃取方法引入到烟草及无烟气烟草制品中挥 发性N-亚硝胺的前处理中，以实现对基质的净化，该前处理方法简便快速；采用GC-MS/MS 可同时对烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺进行定性和定量分析，样品分析干扰 少、灵敏度高、重现性好，为准确评估烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺的安全风 险提供技术支撑。
【具体实施方式】
[0012] 本发明结合实例作进一步描述，但并不限制本发明。
[0013] 实例 1 对配制系列标准溶液进行GC-MS/MS测定，得到线性方程和相关系数。检出限（LODs)是 由三倍信噪比对应的样品浓度来确定，定量限（LOQs)是由10倍的信噪比对应的浓度来确 定的。结果表明方法线性好、检出限低(结果见表3 )。
[0014] 表3 9种挥发性N-亚硝胺的标准曲线、检出限和定量限
实例2 在样品处理前加入定量的低、中、高三种标准品溶液，同时做6次测定，得到烟叶中9种 挥发性N-亚硝胺含量，结果表明方法精密度均小于16%，准确度在84. 1%-118%之间（结果见 表4)〇
[0015] 表4方法的回收率和精密度（％)
实例3 按照上述
【发明内容】
中步骤测定4种国内烟叶中的挥发性N-亚硝胺含量，结果见表5。
[0016]实例 4 按照上述
【发明内容】
中步骤测定来源于美国、英国和瑞典的无烟气烟草制品的挥发性 N-亚硝胺含量，结果见表6。
【主权项】
1. 一种烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺的GC-MS/MS分析测定方法，包括 N-亚硝基二甲胺（NDMA)、N-亚硝基吡咯（NPYR)、N-亚硝基哌啶（NPIP)、N-亚硝基甲基 乙基胺（NMEA)、N-亚硝基二乙胺（NDEA)、N-亚硝基甲基丁基胺（NMBA)、N-亚硝基二丙胺 (NDPA)、N-亚硝基吗啉（NMOR)、N-亚硝基二丁胺（NDBA)9种挥发性N-亚硝胺，其特征在于： 是将烟叶样品磨碎成粉末状后或者是无烟气烟草制品样品，准确称取，加入碱性二氯甲烷 和内标溶液，于振荡器上振荡，加入无水硫酸镁，手持振荡，然后加入N-丙基乙二胺（PSA) 和石墨碳，再次手持振荡混合均匀；然后振荡、离心，取上清液氮吹浓缩，最后用GC-MS/MS 进行测定，具体步骤如下： (1) 样品萃取：将准确称取的4 g样品放于50 mL离心管中，加入4 mL浓度0.1 mol/ L氢氧化钠溶液手持振荡15 s，然后加入30 mL二氯甲烷和20 PL内标工作溶液，于振荡器 中振荡20 min ; (2) 样品溶液净化：加入4 g无水硫酸镁除去水分，再加入I g PSA和0. 5 g石墨碳， 进行样品溶液净化处理； (3) 振荡和离心：样品在振荡器上以280 rpm的速度振荡2 min，在高速离心机上以 10000 rpm的转速离心5 min ; (4) 浓缩：离心后取上清液在45°C恒温水浴中氮吹浓缩至I mL左右，将其转移至2 mL 色谱小瓶中，作为待测样品溶液； (5) GC-MS/MS测定：将标准溶液和样品溶液按照下表中GC-MS/MS仪器工作参数进行测 定：〇2. 根据权利要求1所述的GC-MS/MS分析测定方法，其特征在于：所述内标为浓度均为 20 ng/mL 的 NDMA-D6、NMEA-D3、NDEA-D10、NDPA-D14、NM0R-D8、NPYR-D8、NPIP-D8、NDBA-D8 的二氯甲烷溶液；其中NDPA-D14为NMBA和NDPA的内标。3. 根据权利要求1所述的GC-MS/MS分析测定方法，其特征在于：所述标准溶液以二氯 甲烧为溶剂，配制挥发性N-亚硝胺的系列标准溶液：2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/ mL、50 ng/mL、100 ng/mL和200 ng/mL;分别加入内标，使各内标物的浓度均为20 ng/mL。
【专利摘要】一种烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺的GC-MS/MS分析测定方法，其特征在于：是将烟叶样品磨碎成粉末状后或者是无烟气烟草制品样品，准确称取，加入碱性二氯甲烷和内标溶液，于振荡器上振荡，加入无水硫酸镁，手持振荡，然后加入N-丙基乙二胺（PSA）和石墨碳，再次手持振荡混合均匀；然后振荡、离心，取上清液氮吹浓缩，最后用GC-MS/MS进行测定。本发明的优点在于：首次将基质分散固相萃取方法引入到烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺的前处理中，以实现对基质的净化，其前处理方法简便快速，样品分析干扰少、灵敏度高、重现性好，为准确评估烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺的安全风险提供技术支撑。
【IPC分类】G01N30/88, G01N30/06
【公开号】CN105353068
【申请号】CN201510899119
【发明人】郭军伟, 吕芳, 王洪波, 刘绍锋, 赵乐, 谢复炜, 樊美娟, 潘立宁, 陈黎
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月9日