一种柱前衍生化高效液相色谱法测定西洋参中拟人参皂苷f11的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种柱前衍生化高效液相色谱法测定拟人参皂苷Fll的方法，属于分 析化学领域。
【背景技术】
[0002] 西洋参为五加科植物西洋参L.)的干燥根，具有补气养 精、镇静解热之效，可用于气虚阴亏，虚热烦倦，咳喘痰血，内热消渴，口燥咽干等证，近年来 深受大家的青睐。
[0003] 人参为五加科植物人参（C. A. Mey.)的干燥根和根莖，具有大补 元气、固脱生津的功效。人参主产于我国东北地区，价格相对便宜。西洋参主产于美国和加 拿大，价格昂贵，且由于西洋参与人参在性状及其化学成分上都极其相似，所以近年来以人 参冒充西洋参或在西洋参中掺杂人参的现象屡见不鲜。但二者药理作用却相差甚远，西洋 参滋补降火，人参提气助火，效用相反。为了保证西洋参的品质，确保患者的用药安全，对西 洋参的质量品质研究十分必要。
[0004] 西洋参与人参的主要活性成分都是人参皂苷，另外还含有大量多糖、氨基酸及聚 乙炔等其它成分。研究表明，人参皂苷具有保护心脑血管系统，提高免疫功能，抗衰老和抗 疲劳，调节中枢神经系统，调节内分泌系统，抗肿瘤等药理作用。
[0005] 人参皂苷按结构分类，包括原人参二醇型皂苷，如：人参皂苷Rbl，人参皂苷Rb2， 人参皂苷Rc，人参皂苷Rd等；原人参三醇型皂苷，如：人参皂苷Re，人参皂苷Rgl等；齐墩 果酸型皂苷，如：人参皂苷R〇,人参皂苷R3,人参皂苷R4等；其他类型人参皂苷，如：人参皂 苷Rh3,人参皂苷Rg5,人参皂苷F4等。西洋参中还包括一类特有皂苷成分一奥克梯隆型皂 苷，包括拟人参阜苷Fll等，该成分是区别西洋参与人参的特征成分。
[0006] 目前对西洋参真伪的研究方法主要有性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、荧光鉴别、 蛋白电泳鉴别及DNA鉴别等。而利用其化学成分上的区别进行品质保证的方法很少见。
[0007] 拟人参皂苷Fll是区别西洋参与人参的特征成分，因此对拟人参皂苷Fll测定的 研究对西洋参的品质保证具有非常重要的意义。由于拟人参皂苷Fll结构中无发色团， 没有紫外吸收，因此不能采用紫外检测器检测。目前发明专利中，罗国安等人在专利CN 101685089 B中公开了一种通过超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用测定拟人参 皂苷Fll和人参皂苷Rf来快速检测西洋参及其制剂质量真伪的方法，文献报道测定西洋参 中拟人参皂苷Fll含量的方法主要集中在HPLC-ELSD上。对于柱前衍生化技术，李章万等 人利用柱前衍生化高效液相色谱法测定了红参及生脉饮注射液中人参二醇和人参三醇的 含量，石李梁等人利用柱前衍生化高效液相色谱法测定了人参中人参二醇的含量。目前暂 无利用柱前衍生化技术测定西洋参中拟人参皂苷Fll的含量报道。
[0008] 该发明采用柱前衍生化技术将拟人参皂苷Fll进行柱前衍生化，引入具有紫外吸 收的苯甲酰基，可以利用紫外检测器进行检测，方法简便、稳定，为进一步完善西洋参的质 量评价提供了新的思路。
【发明内容】
[0009] 本发明所述的柱前衍生化高效液相色谱法测定西洋参中拟人参皂苷Fll的方法， 采用高效液相色谱仪紫外检测器进行测定，并用外标法进行定量。
[0010] 具体步骤包括： 1. 对照品的制备：精密称取50mg拟人参皂苷Fll对照品于IOmL棕色容量瓶中，用甲 醇溶解，超声，放至室温后定容，摇匀，备用； 2. 样品的处理：称取l_2g样品粉末，加入15-20mL甲醇超声提取20-30min，放冷过滤， 收集滤液，重复提取二到三遍，最后一遍过滤后残渣用少量甲醇冲洗3次并过滤，合并滤液 浓缩。浓缩后残渣分别用甲醇转移到IOmL棕色容量瓶中，定容，摇匀，备用； 3. 衍生化反应条件：拟人参皂苷Fll对照品衍生化反应条件为：精密吸取吡啶 0. 8-1. 5mL，分别加入拟人参皂苷Fll对照品溶液0. 5-1. 5mL、苯甲酰氯4-8mL，涡旋混合 10-20min，用甲醇定容到一定体积，备用； 4. 色谱条件：使用十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱，检测器为紫外-可见光检测器。 以水为A相，65%-80%乙腈或甲醇水溶液（V/V)为B相进行梯度洗脱，流速为0. 8-1. 2mL/ min，检测波长为220-250nm，柱温25-35°C，进样量为1〇-2〇μL ; 梯度程序：
5. 标准曲线的绘制：取步骤1中配制的拟人参皂苷Fll对照品，用甲醇分别配制拟人 参阜苷Fll浓度为5mg/mL, 4mg/mL, 3mg/mL, 2mg/mL, lmg/mL的溶液，按步骤3中的衍生 化反应条件操作，按步骤4的色谱条件进行分析测定，以对照品浓度（μ g/mL)为横坐标，峰 面积（A)为纵坐标做标准曲线，得到回归方程式； 6.样品的测定：按步骤2的方法制备样品溶液，按步骤3衍生化步骤处理样品，液相方 法同步骤4,测定拟人参皂苷Fll色谱峰面积。根据步骤5中回归方程计算拟人参皂苷Fll 浓度，进而根据样品溶液配制方法计算得出拟人参皂苷Fll的含量。
【附图说明】
[0011] 附图1为拟人参皂苷Fl 1对照品的高效液相色谱图。
[0012] 附图2为西洋参样品的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1 : 1. 对照品的制备：精密称取拟人参皂苷Fll对照品（纯度为97. 5%)51. 431mg于IOmL棕 色容量瓶中，用甲醇溶解，超声，放至室温后定容，摇匀，备用，对照品溶液浓度为5. 0145mg/ mL ； 2. 样品的处理：分别精密称取西洋参根粉末I. 021g，I. 015g，I. 023g于50mL锥形瓶 中，分别加入20mL甲醇超声提取30min，放至室温后过滤至250mL圆底烧瓶中，重复提取三 次，最后一遍过滤后残渣用少量甲醇冲洗3次并过滤，每次15mL，合并滤液浓缩。浓缩后残 渣分别用甲醇转移到IOmL棕色容量瓶中，定容，摇匀，备用； 3. 色谱条件：使用C18色谱柱，检测器为紫外-可见光检测器。以水为A相，75%乙腈 水溶液（V/V)为B相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为230nm，柱温30°C，进样 量为2〇μL ; 4. 衍生化反应：取5个IOmL棕色容量瓶，分别精密加入吡啶1.0 mL，再分别加入5种不 同浓度拟人参皂苷Fll对照品溶液1.0 mU苯甲酰氯5. OmL，涡旋混合IOmin后，用甲醇定容 到10mL，过0. 45 μ m滤膜。取3个IOmL棕色容量瓶，对3个样品溶液进行同样的衍生化反 应，备用； 5. 标准曲线的绘制：取拟人参皂苷Fll对照品，用甲醇分别配制拟人参皂苷Fll浓度 为 5.0145mg/mL, 4.0116mg/mL, 3.0087mg/mL, 2.0058mg/mL, 1.0029mg/mL 的溶液。根据 步骤3的色谱条