碱性磷酸酶(nap)染色液(化学染色法)的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及碱性磷酸酶（NAP)染色液（化学染色 法），即一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法。
【背景技术】
[0002] 碱性磷酸酶（NAP)主要存在于成熟中性粒细胞，是一种胞内非特异性水解酶，在 碱性条件下能水解多种磷酸酯。随着细胞的成熟，NAP的活性也逐渐增强。在病理情况下， 不同疾病及疾病的不同阶段均可引起NAP成分与含量的变化，因此，作为快速测定碱性磷 酸酶活性的化学染色法经常被用作各种疾病的临床辅助诊断指标。NAP活性变化对某些疾 病的鉴别与诊断具有重要的临床价值：当患有慢性粒细胞白血病时（无继发感染时），其活 性显著减低，缓解期可恢复至正常范围，加速期和急变期时，NAP活性可不同程度增高，该检 测可作为观察慢粒白血病疗效和预后的一项指标，也是与类白血病反应鉴别的重要检测项 目。急性粒细胞白血病，NAP活性降低，并发感染时可稍增高。NAP活性减低还常见于病毒 感染或寄生虫、立克次体感染，恶性组织细胞增生症和淋巴瘤等。至于中性粒细胞碱性磷酸 酶活性增高的情况则比较多见，如妊娠16W~20W孕妇，NAP水平显著增高，其他如细菌性 炎症、类白血病反应、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、多发性骨髓瘤、真性红细 胞增多症、急性淋巴细胞白血病等也伴随有NAP积分增高现象。
[0003] 碱性磷酸酶的染色方法主要有金属盐沉淀法和偶氮偶联法。
[0004] 金属盐沉淀法中最经典的是Gomori的钙钴法，其原理是以β -甘油磷酸为底物， 在ρΗ9. 3的碱性条件下水解为磷酸钠和甘油，磷酸钠与钙离子作用生成磷酸钙，再与钴离 子作用生成磷酸钴，后者与硫化铵作用生成不溶性硫化钴沉淀。由于钙钴法存在操作繁琐、 费时、有特殊不良气味、硫化铵污染等缺点，目前医疗临床上已经很少应用。
[0005] 1955年kaplow LS提出了用偶氮偶联法对细胞中的碱性磷酸酶进行染色，其原理 是利用碱性磷酸酶在PH9. 2-9. 8的碱性环境下，水解α -磷酸萘酚钠，产生α -萘酚，后者 与重氮剂偶联成有色沉淀物的原理进行染色。但是，α-萘酚为未取代萘酚，与偶氮的有效 偶联需要加入过量的重氮盐，对酶活性可能造成阻抑作用，其分解产物对细胞具有非特殊 性染色作用，且每次试验需要临时配制孵育液。后期有许多学者找到了 α-磷酸萘酚钠盐 的替代品，如萘酚AS-BI磷酸钠盐、萘酚AS-MX磷酸钠盐，应用该方法染色具有快速、简便、 容易重复等优点，但始终存在阳性染色不明显、显色灵敏度偏低等问题。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供碱性磷酸酶（NAP)染色液（化学染色法），即一 种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法，使所述试剂盒以及染色方法应用于血 细胞内碱性磷酸酶检测时能够提高阳性染色效果。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色 方法，使所述试剂盒以及染色方法应用于血细胞内碱性磷酸酶检测时能够提高显色灵敏 度。
[0008] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0009] -种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒，包括pH值为9. 2-9. 8的碱性磷酸酶底物 溶液，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲酰 胺。
[0010] 作为优选，所述N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺浓 度为0· 125mg/ml~lmg/ml，更优选0· 25mg/ml~0· 5mg/ml，其分子结构如下：
[0012] 与传统较常用的底物萘酚AS-BI磷酸钠盐、萘酚AS-MX磷酸钠盐相比，本发明试剂 采用的底物在原有发色基团萘甲酰的N位上引入了另一发色基团联苯基，且在联苯基的2 位和5位分别用助色基团甲基和甲氧基取代，可以增强碱性磷酸酶水解底物产生的萘酚与 偶氮盐反应的显色强度，从而大大提高了碱性磷酸酶的显色灵敏度。
[0013] 所述碱性磷酸酶底物N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲 酰胺的合成方法为：以2-羟基-3-萘甲酸（化合物1)和5-甲基-4-苯基邻茴香胺（化合 物2)为原料，三氯化磷为羧基和氨基的缩合剂，获得3-羟基-N- (2-甲基-5-甲氧基-4-联 苯基）-2_萘甲酰胺（化合物3);再通过五氯化磷磷酸化，最终获得N-(2-甲基-5-甲氧 基-4-联苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺（化合物4)。
[0014] 合成路线如下：
[0015] CN 105181423 A W 切卞 3/7 页
[0016] 作为优选，所述碱性磷酸酶底物溶液中还包括基质缓冲液、稳定剂、防腐剂和无机 盐。
[0017] 其中，所述基质缓冲液优选自Tris-HCl缓冲液、2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇缓冲 液、巴比妥缓冲液、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种；
[0018] 所述基质缓冲液浓度优选为0· IM ;
[0019] 所述无机盐优选为氯化钠或氯化镁；
[0020] 所述无机盐浓度优选为0· 1M。
[0021 ] 所述稳定剂优选为甘油、PVP或TWEEN20,防腐剂优选为NaN3。
[0022] 作为优选，本发明所述试剂盒还包括常规NAP染色一般都会具备的固定液、重氮 盐和苏木素复染液。
[0023] 其中，所述固定液选自1%~30% (v/v)甲醛甲醇、30%~80% (v/v)丙酮-枸 缘酸溶液、70%~95% (v/v)甲醇中的一种，更优选1%~30% (v/v)甲醛甲醇，尤其优选 10%~20% (v/v)甲酸甲醇；
[0024] 所述重氮盐选自固红TR盐、固黑K盐、固蓝BB盐、固红GBC盐、耐晒猩红R盐、固 红紫LB盐、固紫B盐、固暗蓝R盐、固蓝B盐、新品红溶液中的一种，更优选固红TR盐、固紫 B盐、耐晒猩红R盐。
[0025] 苏木素复染液可按照本领域常规方法用苏木精配制，或直接市售购买。本发明所 述苏木素复染液优选含有如下试剂：0.05%~1 % (w/v)苏木精，10%~50% (v/v)无水乙 醇，0· 01%~0· 1% (w/v)碘酸钠，10%~50% (v/v)甘油，0· 5%~5% (w/v)硫酸错钾， 0. 5%~10% (w/v)枸缘酸，其余为蒸馏水。复染液pH范围为1. 8~2. 9。
[0026] 上述苏木素复染液中苏木精与碘酸钠的比例可以为1:0. 05-1: 1，优选 1:0. 1-1:0. 5,尤其优选 1:0. 1-1:0. 2。
[0027] 根据本发明提供的适用于血细胞碱性磷酸酶染色的试剂盒产品，本发明还提供一 种中性粒细胞碱性磷酸酶染色方法，包括：
[0028] 步骤1、向新鲜待测血液涂片滴加固定液固定，固定后水洗待干；
[0029] 步骤2、将重氮盐置入pH值为9. 2-9. 8的碱性磷酸酶底物溶液中完全溶解，混合成 为染色工作液，将固定后血液涂片置入染色工作液中孵育，之后流水冲洗，取出待干；
[0030] 步骤3、向血液涂片中滴加苏木素复染液复染，水洗待干，镜检；
[0031] 其中，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基）-3_磷酸氧 基-2-萘甲酰胺。
[0032] 作为优选，上述染色方法还可以进一步为
[0033] 步骤1、向新鲜待测血液涂片滴加4°C预冷的固定液固定30秒，固定后水洗待干；
[0034] 步骤2、将重氮盐置入pH值为9. 2-9. 8的碱性磷酸酶底物溶液中完全溶解，混合成 为染色工作液，将固定后血液涂片置入染色工作液中37°C孵育30分钟，之后连缸流水冲洗 1-5分钟，取出待干；
[0035] 步骤3、向血液涂片中滴加苏木素复染液，室温复染1-2分钟，水洗待干，镜检。
[0036] 作为优选，重氮盐与N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲 酰胺的摩尔浓度比为2:1~8:1，在本发明的一些实施例中，重氮盐与N-(2-甲基-5-甲氧 基-4-联苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺的摩尔浓度比为3. 58:1。
[0037] 作为优选，所述碱性磷酸酶底物溶液中还包括基质缓冲液、稳定剂、防腐剂和无机 盐。
[0038] 其中，所述基质缓冲液、稳定剂、防腐剂、无机盐、固定液、重氮盐和苏木素复染液 可参照试剂盒中优选的技术方案。
[0039] 在和现有的NAP染色方法的对比试验中，本发明染色效果为细胞核为蓝色，胞浆 中出现红色沉淀，胞核和胞浆染色颜色鲜艳、对比清晰、鲜明。而对比的现有方法胞浆中出 现红色沉淀颜色较淡，与细胞核的颜色对比并不鲜明。
[0040] 同时，在检测急性淋巴细胞白血病、细菌性感染、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤、 阵发性睡眠性血红蛋白尿病、慢性粒细胞性白血病和恶性组织细胞病共169例患者的NAP 活性试验中，本发明能够显著增加患者NAP染色阳性率结果，表明本发明试剂盒和染色方 法灵敏度更高，增加阳性染色。
[0041] 由以上结果可知，本发明以碱性磷酸酶底物替代现有萘酚AS-BI磷酸钠盐、萘酚 AS-MX磷酸钠盐等进行NAP染色，该底物化学结构中通过引入发色基团联苯基，增强碱性磷 酸酶水解底物产生的萘酚与偶氮盐反应的显色强度，从而大大提高了碱性磷酸酶的显色灵 敏度和阳性染色。
【附图说明】
[0042] 图1所示以本发明NAP染色方法的正常人外周血细胞涂片的镜检结果；
[0043] 图2所示以本发明NAP染色方法的妊娠17周孕妇外周血细胞涂片的镜检结果；
[0044] 图3所示以现有NAP染色方法的正常人外周血细胞涂片的镜检结果；
[0045] 图4所示以现有NAP染色方法的妊娠17周孕妇外周血细胞涂片的镜检结果。
【具体实施方式】
[0046] 本发明实施例公开了一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法。本领 域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替 换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产 品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和 范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0047] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种中性粒细胞碱性磷 酸酶染色试剂盒以及染色方法进行详细说明。
[0048] 实施例1 :N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺的合成
[0049] 将 54g(0. 29mol)2-羟基-3-萘甲酸、60