Ev71 3c蛋白酶作用靶点检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，及检测方法。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（enterovirus71，EV71)是手足口病的主要致病原之一。临床上 多表现为轻微症状：发热、手足口部的疱疹、疱疹性咽峡炎。而严重者则引起神经系统并发 症如无菌性脑膜脑炎、脊髓炎、神经源性的肺水肿等。严重者有生命危险。临床上治疗EV71 感染主要是对症治疗，目前尚无特异抗病毒药物，寻找和发现抗EV71病毒药物是目前面临 的中药课题。
[0003] 寻找抗EV71药物目前主要有2大途径：1 :在已知病毒蛋白功能域的基础上进行 针对性设计；2:在中草药、海洋生物、陆地微生物等自然界中萃取、寻找。后者往往是新结 构、新机制抗病毒药物的重要来源，对于抗病毒药物的研究具有重要意义，但是，这些自然 资源中获得的化合物的抗病毒作用靶点却常常存在难度。因此，寻找靶点并开发一套合适 的检测方法是急需解决的问题。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术，本发明以3C蛋白为抗病毒作用靶点，开发了一套检测试剂盒 及检测方法，其目的是检测待检测化合物是否可抑制3C蛋白，进而判断其是否可抑制EV71 病毒，是否可以作为抗EV71病毒的药物进行研究应用。
[0005] 3C蛋白是手足口病病原EV71的蛋白酶，其酶活性直接影响病毒复制效率和致病 毒力（WengK.F. ,LiM.L. ,HungC.T.etal.Enterovirus7I3Cproteasecleavesa noveltargetCstF-64andihibitscellularpolyadenylation[J]?PLOSPathog，2009， 5(9) :el000593.)。本研究以该蛋白酶测活方法为基础，建立了 3C蛋白酶活性的成套试剂， 用于检测药物靶点。如果药物可以抑制3C蛋白酶的活性，则提示该药物的作用靶点是EV71 的3C蛋白酶的酶活中心（His41，Glu71和Cysl47催化三联体）。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，包括3C蛋白、多肽底物，以及酶解反应 缓冲液，所述3C蛋白的序列如下（如SEQIDNO. 1所示）：
[0008] GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAVLPRHSQPGKTIWVEHKLVNVLDAVELVDEQGVN LELTLITLDTNEKFRDITKFIPENISTASDATLVINTEHMPSMFVPV⑶WQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQ CGGVVTSVGKVVGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQo
[0009]所述多肽底物为DabcyI-EALFQGPPKFE-Edans，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示， N端连接Dabcyl基团，C端连接Edans基团。
[0010] 所述酶解反应缓冲液为反应buffer液，其包括如下组分：25mMTriS-HCKpH 8. 0)，200mMNaCl〇
[0011] -种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测方法，如下：将待检测化合物、3C蛋白加入到酶 解反应缓冲液中，然后加入多肽底物，混匀，反应30min后，在336nm波长激发下，检测其在 490nm处的荧光强度；若检测不到荧光，则表明该待检测化合物能抑制3C蛋白，具有抗EV71 病毒能力，可作为抗EV71病毒的药物进行进一步的研究应用；若能够检测到荧光，则表明 该待检测化合物不能抑制3C蛋白。
[0012] 进一步地，检测方法如下：多肽底物在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧 光强度值A(表示未降解时的荧光强度）。将3C蛋白多肽底物加入到反应buffer液后，混 匀反应30min后，倒入玻璃比色皿中，在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧光强度 值B(经降解后的荧光强度）。在上述反应体系中加入一定浓度的待检测化合物，并重复以 上步骤操作，获得化合物存在时的荧光强度C，通过比较A，B，C三值大小，确定化合物对3C 蛋白酶的酶活性的影响（C的数值在A、B之间，C的数值越小，说明待检测化合物对3C蛋白 酶的酶活性的抑制越明显，C的数值越大，说明待检测化合物对3C蛋白酶的酶活性的抑制 越弱）。
[0013] 本发明的原理为：该成套检测试剂主要由3C蛋白及荧光多肽底物组成。3C蛋白对 底物进行酶解后，由于底物两端的基团分离，荧光淬灭消失，反应产物激发出荧光信号。通 过比较野生组与对照组的荧光发射曲线差异，判断化合物是否影响了 3C蛋白酶对底物的 降解活性，进而筛选对抗EV71 3C蛋白酶的靶标化合物，后续还可通过计算3C的米氏常数 Km值及催化效率Kcat值，定量判定靶标化合物的抑制能力。
[0014] 本发明的检测试剂盒及方法，可有效对待检测化合物的抗EV71能力（是否以3C 蛋白为靶点）进行检测，方法简便，易行，特异性及灵敏性高。
【附图说明】
[0015] 图1 :抑制剂对3C蛋白降解2C-3A多肽的影响。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0017] 下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有 的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检 测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
[0018] 实验EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒及检测方法的研究
[0019] 1 :材料：
[0020] 1.1:3C蛋白
[0021] 采用分子克隆方法获得3C基因的原核表达质粒，使用大肠杆菌B121菌株进行蛋 白的表达和纯化（公知技术）。肽序列如下（如SEQ ID NO. 1所示）：
[0022] GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAVLPRHSQPGKTIWVEHKLVNVLDAVELVDEQGVN LELTLITLDTNEKFRDITKFIPENISTASDATLVINTEHMPSMFVPV⑶WQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQ CGGVVTSVGKVVGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQo
[0023] 3C蛋白第147位半胱氨酸酶活中心的C为酶活中心的关键氨基酸。
[0024] 1.2:荧光多肽底物
[0025] 发明人前期检测了3C蛋白酶对6条10肽底物的酶活，寻找到一条在水溶液中稳 定性好、并被3C蛋白高效降解的多肽（表1)。这一底物是基于EV71上2C-3A蛋白序列设 计。酶解位点为谷氨酰胺与甘氨酸之间的肽键。多肽的N端连接Dabcyl基团，C端连接 Edans基团。
[0026] Dabcyl和Edans两基团靠近时发生荧光催灭，不显示荧光。当多肽被降解后，两基 团分离，在336nm波长光激发下，可在490nm处检测到焚光。
[0027] 表1荧光多肽底物
[0028]
[0029] 2方法步骤：蛋白酶活力测定实验
[0030] 2. 1 :酶活性检测
[0031] 2. L 1酶活反应体系如下：
[0032] 3C蛋白 2ul(0. 5uM);
[0033]多肽底物 5uI(IOuM);
[0034]反应buffer液（25mMTris-HClpH8. 0, 200mMNaCl) 13ul〇
[0035] 2.I.2酶活测定方法
[0036] 多肽底物在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧光强度值A(表示未降解 时的荧光强度）。将3C蛋白多肽底物加入到反应buffer液后，混匀反应30min后，倒入玻 璃比色皿中，在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧光强度值B(经降解后的荧光强 度）。在上述反应体系中加入一定浓度的待检测化合物，并重复以上步骤操作，获得化合物 存在时的荧光强度C，通过比较A，B，C三值大小，确定化合物对3C蛋白酶的酶活性的影响。
[0037] 2. 1. 3酶活测定原理
[0038] 多肽的N端连接Dabcyl基团，C端连接Edans基团。Dabcyl和Edans两基团靠近 时发生荧光催灭，不显示荧光。当多肽被逐渐被3C蛋白酶降解后，两基团分离，在336nm波 长光激发下，可在490nm处检测到荧光，并且随着降解的加速荧光逐渐变强直至反应完全。 通过比较评价受试样品对反应产物荧光强度的影响，进而确定其是否通过抑制3C蛋白酶 活性发挥抗病毒药效。
[0039] 2. 2 :实验结果
[0040] 2. 2. 1抑制剂芦平曲苇（Rupintrivir)对3C蛋白降解底物2C-3A的酶活抑制
[0041] 分别取0. 5uM3C蛋白加入到含多肽底物的反应体系中，混匀反应30min中后测定 336nm波长激发下，在490nm处的荧光强度，根据以上实验方法，分别检测有无5uM抑制剂芦 平曲苇存在时的荧光强度，作图。
[0042] 结果如图1所示，由图可知，在无抑制剂芦平曲苇存在时，3C蛋白不受到抑制，可 降解多肽底物，可检测到较强的荧光。在有5uM抑制剂芦平曲苇存在时，3C蛋白受到抑制， 不降解多肽底物，几乎检测不到荧光。
【主权项】
1. 一种EV713C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，其特征在于：包括3C蛋白、多肽底物，以 及酶解反应缓冲液，所述3C蛋白的序列如下（如SEQ ID NO. 1所示）： GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAVLPRHSQPGKTIWVEHKLVNVLDAVELVDEQGVNLE LTLITLDTNEKFRDITKFIPENISTASDATLVINTEHMPSMFVPV⑶WQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQC GGVVTSVGKVVGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQ； 所述多肽底物为Dabcyl-EALFQGPPKFE-Edans，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，N端 连接Dabcyl基团，C端连接Edans基团。2. 根据权利要求1所述的EV713C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，其特征在于：所述酶解 反应缓冲液为反应buffer液，其包括如下组分：25mMTris-HCKpH8.0)，200mMNaCl。3. 根据权利要求1或2所述的EV713C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，其特征在于：包括 以下物质：〇. 5uM 3C蛋白2ul ;10uM多肽底物5ul ;反应buffer液13ul。4. 一种利用权利要求1~3中任一项所述的EV713C蛋白酶作用靶点检测试剂盒进行 检测的方法，其特征在于：将待检测化合物、3C蛋白加入到酶解反应缓冲液中，然后加入多 肽底物，混勾，反应30min后，在336nm波长激发下，检测其在490nm处的焚光强度；若检测 不到荧光，则表明该待检测化合物能抑制3C蛋白，具有抗EV71病毒能力；若能够检测到荧 光，则表明该待检测化合物不能抑制3C蛋白。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：多肽底物在336nm波长激发下，获得 其在490nm处的荧光强度值A，表示未降解时的荧光强度；将3C蛋白多肽底物加入到反应 buffer液后，混勾反应30min后，倒入玻璃比色皿中，在336nm波长激发下，获得其在490nm 处的荧光强度值B，表示经降解后的荧光强度；在上述反应体系中加入一定浓度的待检测 化合物，并重复以上步骤操作，获得化合物存在时的荧光强度C，通过比较A，B，C三值大小， 确定待检测化合物对3C蛋白酶的酶活性的影响。
【专利摘要】本发明公开了一种EV71？3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，包括3C蛋白、多肽底物，以及酶解反应缓冲液，所述3C蛋白的序列如SEQ？ID？NO.1所示；所述多肽底物为Dabcyl-EALFQGPPKFE-Edans。本发明还公开了一种EV71？3C蛋白酶作用靶点检测方法：将待检测化合物、3C蛋白加入到酶解反应缓冲液中，然后加入多肽底物，混匀，在336nm波长激发下，检测其在490nm处的荧光强度；若检测不到荧光，则表明该待检测化合物能抑制3C蛋白；若能够检测到荧光，则表明该待检测化合物不能抑制3C蛋白。本发明的检测试剂盒及方法，可有效对待检测化合物的抗EV71能力进行检测，方法简便，易行，特异性及灵敏性高。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105067574
【申请号】CN201510342092
【发明人】李冰清, 孟红, 秦立增, 李鹏, 李志会, 岳盈盈, 宋楠楠
【申请人】山东省医学科学院基础医学研究所, 山东中医药大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年6月18日