一种定性定量检测口蹄疫病毒抗原的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品检测技术领域，具体地说，涉及一种定性定量检测口蹄疫病 毒抗原的方法。
【背景技术】
[0002] 目前口蹄疫病毒灭活抗原的检测主要依靠蔗糖密度梯度法定量病毒146S检测， 通过146S检测的本质是完整病毒，而完整病毒样品在处理中易破碎，因此导致检测的误差 大；同时146S测定的是口蹄疫病毒抗原的相对物理含量，缺乏特异性，并且不能对其进行 定性检测。
[0003] 现有的ELISA方法检测口蹄疫病毒抗原含量存在细胞碎片等背景干扰的缺陷，容 易出现假阳性、假阴性等结果，稳定性差。
[0004] 现有的免疫印迹方法只能定性、不能定量检测抗原，同时检测浓度范围非常有限， 现有免疫印迹方法存在显著缺陷而尚未应用于口蹄疫抗原定量检测中。
[0005] 因此，建立一种通过免疫学原理能稳定地定性、定量检测口蹄疫抗原的方法非常 迫切而且有必要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有口蹄疫病毒检测中存在的缺陷，提供一种定性和定量 检测口蹄疫病毒的方法。
[0007] 为达到以上目的，本发明提供了一种口蹄疫抗原的检测方法，包括利用免疫印迹 发光结合灰度值方法对口蹄疫抗原进行定性和定量检测，所述方法包括以下步骤：
[0008] (1)将待测样品与SDS缓冲液按1:4的体积比混合后在100 °C沸水浴中处理 5-10分钟，冷却至4-25°C获得上样样品；将所述上样样品在SDS-PAGE电泳胶中进行电泳， SDS-PAGE电泳胶为用12 %分离胶和5 %浓缩胶配制获得的；在60-100伏的电压下电泳 20-30分钟，待上样样品中的溴酚蓝进入分离胶之后，调整电泳电压至100-120伏，溴酚蓝 到达分离胶底部后停止电泳；
[0009] ⑵转移印迹步骤，将聚偏二氟乙烯膜预先在甲醇中浸泡12-60秒，然后在蒸馏水 中浸泡2-5分钟，最后放入转移缓冲液中平衡5-10分钟、用平衡后的膜进行转膜步骤，转 膜电压90-120伏，时间80-120分钟获得转印膜，将转印膜于封闭液中20-30°C下震荡封闭 1. 5-3小时或于4°C震荡8-10小时；
[0010] (3)免疫孵育步骤，利用口蹄疫病毒兔源阳性血清、VPl单克隆抗体或VP2单克 隆抗体对封闭后的转印膜进行一抗孵育，一抗孵育条件为在37°C孵育2小时或者4°C孵育 8-10小时；二抗为辣根过氧化物酶标记的工作浓度的抗兔IgG或辣根过氧化物酶标记的工 作浓度的抗鼠 IgG，二抗孵育条件为在37°C孵育0. 5-1小时或者4°C孵育8-10小时获得抗 体孵育膜；
[0011] (4)进行显色反应或发光反应：
[0012] 显色反应为：将抗体孵育膜置于工作浓度的显色溶液中显色1-5分钟至棕色条带 出现，双蒸水终止反应。
[0013] 发光反应为：将发光显色液加到抗体孵育膜有蛋白的一面后在超灵敏全自动成像 分析系统中反应1-3分钟。
[0014] 可选的，所述方法包括对待测样品进行如下预处理步骤：
[0015] 步骤1 :将待测样品与NaCl进行第一接触获得NaCl浓度为0. 45-0. 55mol/L第一 混合物；
[0016] 步骤2 :将所述第一混合物与8-10 %聚乙二醇进行第二接触获得第二混合物；
[0017] 步骤3 :将所述第二混合物在4°C静置8-12小时后以10000转/分钟的转速离心 30分钟，收集沉淀，在沉淀中加入PBS充分溶解获得预处理后的待测样品。
[0018] 可选的，在第一混合物中NaCl浓度为0· 5mol/L。
[0019] 可选的，在所述第二接触中，相对于IOOmL的所述第一混合物，聚乙二醇的用量为 8-10g〇 〇
[0020] 可选的，所述方法包括对待测样品进行如下预处理步骤：
[0021] 将所述待测样品以10000转/分钟的转速离心10分钟，取上清，加入100KD再生 纤维膜超滤离心管中以4000转/分钟的转速离心获得预处理后的待测样品。
[0022] 可选的，所述口蹄疫病毒兔源阳性血清的稀释倍数为1:50-100。
[0023] 可选的，所述VPl单克隆抗体或VP2单克隆抗体的稀释倍数为1:50-100。
[0024] 可选的，所述方法还包括根据0型、亚洲I型口蹄疫病毒标准抗原的浓度为横坐 标，灰度值为纵坐标，绘制标准曲线。
[0025] 可选的，所述方法还包括以显色反应获得的条带根据特异性抗原条带判定待测样 品性质；以发光反应获得的待检测样品的灰度值在标准曲线中查出待测样品的浓度，然后 再乘以稀释倍数，得到待检测样品的实际浓度。
[0026] 本发明还提供了所述口蹄疫检测方法在口蹄疫抗原检测中的应用。
[0027] 相比于现有口蹄疫抗原检测技术，免疫印迹发光结合灰度值方法检测口蹄疫抗原 的方法是在分子水平上利用免疫学原理，特异性的识别病毒有效抗原而与病毒状态完整性 无关，病毒的完整性不会影响检测结果，通过单抗、多抗鉴定和反复验证确定了检测的特异 性条带理论上反应的是所有有效抗原的含量；通过预处理抗原，极大的提高了待测样品的 稳定性和检测能力范围；同时该方法不受细胞碎片等背景干扰的影响，通过目的条带的分 析而准确得到有效抗原的定性、定量结果。
[0028] 本发明在免疫学基础上，很好地将口蹄疫抗原定性和定量检测结合起来，同时稳 定性好、无背景干扰，弥补了现有口蹄疫抗原检测技术的缺陷，对于口蹄疫抗原检测技术的 提尚有重要意义。
【附图说明】
[0029] 图1为免疫印迹发光结合灰度值方法确定口蹄疫病毒VPl抗原特异性条带。
[0030] 图2为免疫印迹发光结合灰度值方法确定口蹄疫病毒VP2抗原特异性条带结果 图。
[0031] 图3为免疫印迹发光结合灰度值方法检测口蹄疫病毒抗原阳性对照、阴性对照试 验成立结果图。
[0032] 图4为口蹄疫病毒抗原免疫印迹发光结合灰度值和显色检测结果一致结果图。
[0033] 图5为0型口蹄疫病毒抗原样品免疫印迹发光检测结果。
[0034] 图6为亚洲I型口蹄疫病毒抗原样品免疫印迹发光检测结果。
[0035] 图7为免疫印迹发光结合灰度值检测口蹄疫病毒标准抗原样品平行试验结果。
【具体实施方式】
[0036] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给 出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在 不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0037] 本发明所用到的超灵敏全自动成像分析系统购自美国ProteinSimple公司。超滤 离心管购自Merck Millipore公司。蛋白Marker购自Thermo Scientific公司。二抗购 自中杉金桥公司。口蹄疫病毒兔源阳性血清由兰州兽医研究所提供，口蹄疫抗原VPl单克 隆抗体、口蹄疫抗原VP2单克隆抗体为哈尔滨兽医研究所提供。
[0038] 实施例1免疫印迹发光结合灰度值方法确定口蹄疫病毒抗原特异性条带
[0039] 包括以下步骤：
[0040] (1)处理病毒抗原，SDS-PAGE电泳：
[0041] 样品预处理：将IOmL待测样品以10000转/分钟的转速离心10分钟，取上清，加 入I 00KD再生纤维膜超滤离心管中以4000转/分钟的转速离心获得预处理后的待测样品。
[0042] 处理样品：取预处理后的□蹄疫待测样品、阴性对照、阴性对照与上样缓冲液混 匀，在沸水浴中处理5分钟，冷却至25°C后备用。配制12%分离胶和5%浓缩胶。每孔上样 量为20 μ L，上样后进行电泳，电压控制在60伏，30分钟，样品中的溴酚蓝指示剂到达分离 胶之后，电压升到100伏。
[0043] (2)转膜：
[0044] PVDF膜预先在甲醇中浸泡15秒，然后再在蒸馏水中浸泡2分钟，最后放入转移缓 冲液中平衡10分钟处理。100伏转移1小时40分钟。
[0045] ⑶封闭转印膜，免疫反应：
[0046] 封闭液为5%脱脂奶，转印膜于封闭液中室温下轻轻震荡2小时；同一个样品裁剪 为2部分，一部分一抗用口蹄疫病毒兔源阳性血清（1:100倍稀释）孵育，另一部分一抗用 VP1单克隆抗体（1:100倍稀释）或VP 2单克隆抗体（1:100倍稀释）孵育。相应地，二抗分 别用抗兔源辣根过氧化物酶和抗鼠源辣根过氧化物酶标记。
[0047] (4)病毒抗原检测及分析：
[0048] 显色：将显示溶液以合适体积混合成工作溶液，显色5分钟至条带出现，双蒸水终 止反应。阴性对照、阴性对照试验成立，口蹄疫病毒VPp VPJA原特异性条带位置确定结果 如图1、如图2所示。
[0049] 本试验成功确定了口蹄疫病毒抗原VPp VP2特异性条带位置。
[0050] 实施例2免疫印迹发光结合灰度值