阿片样物质受体的正向变构调节剂和沉默变构调节剂的利记博彩app
【专利说明】阿片样物质受体的正向变构调节剂和沉默变构调节剂
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请要求2013年1月4日提交的美国临时申请序列号61/748,946的优先权，所述 申请通过引用并入本文。
[0002] 发明描述 此处随附含有参考文献（1)至（34)的参考书目，其各自通过引用并入本文。
[0003] 本发明在本文中关于两种化合物进行具体描述，即，BMS-986121和 BMS-986122 (显示于图1)，其出于例举的目的呈现。
[0004] 本发明的申请不意欲在范围中限于这两种化合物。相反，本发明的申请意欲覆盖 发挥功能以提供本发明的所需方面的任何化合物。具体而言，本发明可适用的化合物包括 发挥功能以结合阿片样物质受体且增强正构激动剂的结合亲和力或效力（或两者）的任何 化合物。
[0005] G蛋白偶联受体（GPCR)的超家族，包含跨质H旲蛋白，所述跨质H旲蛋白经由质H旲的 内表面上的异源三聚G蛋白转导信号，导致参与细胞功能的许多方面的细胞内信号传导级 联（1)。这些GPCR的细胞表面位置、组织分布和多样性使其成为药物干预的理想目标。实 际上，约30%的市售药物靶向特异性GPCR活性（1，2)。
[0006]阿片样物质受体是GPCR的A类家族的成员。存在四种阿片样物质受体类型（y， S，k和0RL1)，其共享约60%氨基酸同一性（主要在跨膜结构域中），并且通过异源三聚 G蛋白的Gi/o家族信号传导，导致腺苷酸环化酶的抑制、离子通道活性的调节和细胞中的 转录变化（3)。阿片样物质受体（和许多其他GPCR)也可以通过非G蛋白介导的途径信号 传导，所述途径之一通过抑制蛋白募集至受体而起始。抑制蛋白参与受体脱敏和内 化/再循环（4，5)。阿片样物质受体是控制疼痛的关键目标，并且吗啡及其衍生物通过在 阿片样物质受体、特别是y阿片样物质受体充当激动剂而诱导疼痛缓解（6，7)。阿片样物 质受体已被广泛研究，因为需要更好地控制疼痛，同时试图减少或消除不良副作用。这些副 作用包括耐受性、呼吸抑制、便秘、异常性疼痛和依赖（3, 8)。
[0007] 为了克服这些副作用，研究已集中于开发更选择性的激动剂(其相比于其他阿片 样物质受体类型靶向一种特异性阿片样物质受体类型)，或部分激动剂（其与完全激动剂相 比具有降低的效力）或联合治疗中一起使用的激动剂（9，10)。然而，这些不同方法具有的 单一共同性在于它们靶向该受体的正构（内源性）激动剂结合位点。已经用其他GPCR成 功地使用的一种不同的方法是发现和开发变构配体，其相比于其正构对应物可以具有特定 优点。
[0008] GPCR的变构配体结合受体上的位点，所述位点不同于结合正构（或内源性）激动 剂的位点（11，12)。变构调节剂（AM)可以在目标蛋白表现出一定范围的活性。正向变构 调节剂（PAM)可以不具有任何内在效力，但是，当它们结合受体时增强正构激动剂的结合 亲和力或效力（或两者）。负向变构调节剂（MAM)不具有任何内在效力，但是，当它们结合 受体时抑制正构激动剂的结合亲和力或效力（或两者）。沉默变构调节剂（SAM)，也被称为 中性变构配体（NAL)，结合于所述受体，但对正构激动剂亲和力或效力没有影响。然而，SAM 可以在相同的变构位点充当竞争性拮抗剂，阻断PAM或NAM活性。尽管从治疗的观点来看 不是特别有用，但SAM可以是显示假定的PAM或NAM效应是受体介导的有效工具。最后，变 构激动剂可以结合和产生受体的直接激动剂活化，甚至在正构激动剂不存在的情况下。
[0009] 变构配体具有与正构配体相比表现出相同家族中的GPCR亚型之间更大的选择性 的潜能。对于一些GPCR已经证明了这一点，包括促代谢型谷氨酸受体、腺苷受体和毒蕈碱 受体（13-17)。假设这种增加的选择性基于置于结合相同的内源性配体的密切相关的受体 亚型之间的正构位点的进化限制。变构位点可以不需要这种进化限制。
[0010] 尽管对于阿片样物质受体存在高选择性的正构激动剂配体，PAM的额外优势为作 为疼痛控制中的潜在疗法的阿片样物质受体PAM提供了有趣的机会。
[0011] PAM，不像变构激动剂，在正构激动剂不存在的情况下，当它们结合受体时可不具 有任何效应。因此，调节只有当正构激动剂结合受体时才发生。在体内，这导致细胞信号传 导的时间和空间特征的保留；这是重要的，特别是对于脑和肠神经系统中的复杂神经元网 络的信号传导。此外，通过保持天然受体信号传导的时间方面，PAM可以避免受体下调和由 外源正构激动剂产生的持续受体活化触发的其他补偿机制。因此，可以预期阿片样物质受 体PAM比外源正构激动剂产生更少的耐受性和依赖性。此处，我们描述y阿片样物质受体 PAM和SAM的发现和鉴定。使用抑制蛋白募集测定开发和实施高通量筛选（HTS)。起 因于HTS的y选择性PAM显示在抑制蛋白募集测定和G蛋白介导的信号传导测定中 具有活性（腺苷酸环化酶活性和[ 35S]GTPyS结合的抑制）。这些研究首先描述y选择性 PAM和SAM的存在，暗示正向变构作为用于发现密切调控的疼痛疗法的潜在新颖途径。
[0012] 使用PathHunter?酶互补测定技术（DiscoveRx, CA) (18)从HTS运动鉴定潜在的 阿片样物质受体配体。在该系统中，将被称为酶受体（EA)的半乳糖苷酶的N末端缺 失突变体融合至U20S细胞中稳定表达的0 -抑制蛋白2的C末端。将被称为ProLink ? (PK)的半乳糖苷酶的突变的氨基末端片段融合至在这些细胞（U20S-0PRM1)中重组表 达的0PRM1受体的羧基末端。抑制蛋白结合至活化的y阿片样物质受体导致酶的互补和 酶活性的重构。因此，互补的酶活性可以用作抑制蛋白募集至y阿片样物质受体的量度。 在低（20 nM，~EC1(])浓度的y选择性正构激动剂内吗啡肽-I存在的情况下进行HTS运 动，以鉴定激动剂和正向变构调节剂（PAM)两者。两种化合物被鉴定为潜在的y阿片样物 质受体PAM( y -PAM)。这些化合物已被指定为BMS-986121和BMS-986122,并且它们的结构 显示于图1A和B。BMS-986121和BMS-986122都不自身产生显著的抑制蛋白募集（激 动剂检测模式），但两种化合物都显著增强低浓度的内吗啡肽-I产生的0 _抑制蛋白募集 响应（PAM检测模式）（图1C和D)。在PAM检测模式，BMS-986121使20 nM内吗啡肽-I的 抑制蛋白募集增加至最大有效（1 uM)浓度的内吗啡肽-I诱发的响应的72 (66-78) % 的已随（95%CI)，其中 EC5。（95%CI)为 1. 0 (0? 7-1. 4) uM。BMS-986122 产生类似的 PAM 检 测模式响应，使低浓度的内吗啡肽-I的效应增加至最大内吗啡肽-I响应的79 (73-84) %， 其中 EC5。为 3.0 (2.3-3.8) uM。
[0013] 为了测试响应的特异性，在表达PK-标记的S阿片样物质受体的U20S PathHunter?细胞（U20S-0PRD1)中在类似测定中检查所述化合物。无一化合物在~￡(^。 (0.4 nM)的S激动剂亮氨酸脑啡肽的不存在（激动剂检测模式）或存在（PAM检测模式） 的情况下具有任何显著效应（图1C和D)。这些结果表明BMS-986121和BMS-986122的 效应通过y阿片样物质受体的活化介导，并且所述化合物对于y阿片样物质受体相比于 S -阿片样物质受体是选择性的。
[0014] 为了进一步评估y-PAM活性，在三种功能测定（P-抑制蛋白募集、腺苷酸环化酶 活性的抑制和使用[ 35S]GTPyS结合的G蛋白活化）中测试BMS-986121和BMS-986122。还 在受体结合测定中评估化合物。
[0015] 在各种浓度的各y -PAM不存在或存在的情况下生成0 -抑制蛋白的内吗啡肽-I 介导的募集的浓度-响应曲线（CRC)。BMS-986121(图2A)或BMS-986122(图2B)产生内 吗啡肽-I的效力的浓度依赖且饱和的向左偏移。BMS-986121产生内吗啡肽-I的效力的最 大9倍增加。产生半最大向左偏移的BMS-986121的浓度为1. 7 uM。BMS-986122产生内吗 啡肽-I的效力的最大8倍增加，其中半最大向左偏移值为4. 9 uM(图2C)。
[0016] 阿片样物质受体经由G a 1/￡]蛋白抑制腺苷酸环化酶（19)。为了评估y -PAM对该信 号传导途径的效应，在cAMP积累测定中测量它们的效应。U20S PathHunter?细胞中阿片样 物质激动剂产生的cAMP抑制反应是小的，且不足以稳健测量。因此，重组表达人y阿片样 物质受体（CH〇-y)的中国仓鼠卵巢（CH0)细胞系用于这些实验。在该细胞系中，y阿片样 物质受体激动剂产生毛喉素（1 uM)刺激的cAMP积累的稳健且可重复的抑制。内吗啡肽-I 产生 cAMP 积累的 17 倍降低，且 EC5。为 76 (60-96) pM(图 SI)。BMS-986121 和 BMS-986122 显著增加CH〇-y细胞中~EC1(] (30 pM)浓度的内吗啡肽-I产生的毛喉素刺激的腺苷酸环 化酶活性的抑制（图3A和B)。BMS-986121和BMS-986122两者均提供增强，EC 5。值分别为 2. 2 (1. 7-2. 8)和8. 9 (6. 1-13. 1) uM。在PAM存在的情况下内吗啡肽-I产生的最大抑制 与最大浓度（10 nM)的单独的内吗啡肽-I的最大抑制类似。在该测定中，在任何正构激 动剂不存在的情况下，两种y -PAM也都表现出一些内在激动剂活性，引起cAMP积累的抑制 (图 3A 和 B)。BMS-986121 的低效力激动剂活性（14 (2-100) uM 的 EC5Q;35 (6-63) % 的 E_)并不总是可重复的，并且在一些情况下，太低以致于无法测定浓度响应数据的拟合值。 BMS-986122激动剂活性（41 (20-86) uM的EC5Q;60 (24-95) %的￡_)更加明显。仅在高 于产生内吗啡肽-I响应的显著增强所需的那些的浓度看到BMS-986121和BMS-986122的 激动剂活性，并且两种激动剂响应未能达到内吗啡肽-I的最大效应。
[0017] 在该测定中看到的PAM的激动剂活性和U20S-0PRM1细胞中-抑制蛋白募集测 定中看到的激动剂活性的缺乏之间的差异可能是由于两种测定和/或细胞系的显著受体 储备的差异。在重组CH0细胞中，与U20S PathHunter?细胞中的抑制蛋白募集相比，内吗啡 肽-I对于毛喉素刺激的cAMP积累的抑制的效力强~1000倍，表明与抑制蛋白测定相比， cAMP测定中存在显著水平的受体储备。先前已经显示，在表达高水平的GPCR蛋白的重组细 胞中，PAM可以表现出激动剂活性（尽管在比对于PAM活性看到的浓度更高的浓度）（20)。 实际上，已经表明，PAM是有效变构激动剂，并且观察到的激动剂效力的程度在很大程度上 取决于用于检测信号的系统和测定的灵敏度（21)。
[0018] 接下来，在来自稳定表达重组y阿片样物质受体的C6神经胶质瘤细胞（C6 y)的 膜中的G蛋白活化[35S]GTP y S结合研究中表征y-PAM(22)。在5分钟孵育后测定激动剂刺 激的[35S] GTP y S结合以捕获G蛋白活化的初始速率，这可以在该细胞系中区分部分激动剂 与完全激动剂。10 uM的y阿片样物质受体激动剂DAMG0产生高于基础活性的[35S]GTPyS 结合的 250%刺激，其中 EC5。为 222 (179-274) nM。BMS-986121 (10 uM)导致 DAMGO CRC 的 4 倍向左偏移（57 (37-89) nM 的 ECJ (图 4A)。BMS-986122 (10 uM)导致 DAMGO CRC 向左偏移7倍（32 (25-40) nM的EC5。）（图4B)。在该测定中对于PAM化合物中的任一种 没有检测到任何显著激动剂活性。
[0019] 在100 mM NaCl和10 uM GTPyS存在的情况下测定y阿片样物质受体配体结合。 在饱和结合研究中，y-PAM，BMS-