一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫技术检测领域，特别涉及可用于化学发光免疫检测的一种高效酶 促化学发光底物。
【背景技术】
[0002] 化学发光是指在一个反应体系中通过化学反应生成一种激发态的产物（(f)，在其 回到基态的过程中，释放出的能量转变成光子（能量hY)，从而产生发光现象。
[0003] 化学发光免疫分析是继酶免技术、放免技术、荧光免疫技术之后发展起来的一种 超高灵敏度的微量检测技术，具备灵敏度高、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、 无污染等优点，因此成为世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术，是目前免疫 定量分析最理想的方法。
[0004] 在化学发光免疫分析中，常用发光物质包括鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、1，2-二氧 杂环丁烧化合物（l，2-dioxetanecompound)。其中异鲁米诺和吖啶醋作为示踪分子直接 标记，属于闪光型化学发光反应。鲁米诺和1，2-二氧杂环丁烷化合物依靠酶作为示踪分 子标记，属于酶促辉光型化学发光反应。1，2-二氧杂环丁烷化合物是最新的超灵敏的碱 性磷酸酶（Alkalinephosphatase,AP)底物，在适宜的缓冲液中，随着碱性磷酸酶（AP)的 催化水解作用，1，2-二氧杂环丁烷化合物分解发出的信号可持续20小时以上，是理想的化 学发光物质。国外生产厂家研制出以碱性磷酸酶（AP)为标记物，1，2-二氧杂环丁烷化合 物-3-(2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基）苯-1，2-二氧杂环丁烷（AMPPD)为 底物的试剂盒，与之相匹配的有DPC、AccessSubstrate、BioMerieux、Olympus全自动化学 发光系统。
[0005] 然而AP催化AMPH)的化学反应是水解反应，虽然具有较长的平台期，但是其发光 强度较低，并且起光较慢，因此，该化学反应仍有待优化。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种发光信号强、进入平台期较 快、持续时间长、常温保存期长的碱性磷酸酶的酶促化学发光底物。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] -种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物，其特征在于，所述化学发光底物以水为溶 剂，含有以下组分：
[0009] 2-氨基-2-甲基-1-丙醇；
[0010]AMPPD；
[0011] 以及脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与荧光化合物偶联的发光增强剂（记作H0BEP系列 化合物）。
[0012] 脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与荧光化合物的偶联可起到共表面活性剂的作用，能使 该复合物更好的结合到化学发光缓冲体系中。
[0013] 当H0BEP系列化合物溶于水后，在浓度较低时呈单分子分散状态，或被吸附在溶 液的表面上，从而降低表面张力；而H0BEP系列化合物的浓度增加至溶液表面已经饱和而 不能再吸附时，其分子即开始转入溶液内部，由于H0BEP系列化合物分子的疏水部分与水 的亲和力较小，而疏水部分之间的吸引力较大，当达到一定浓度时，许多H0BEP系列化合物 的疏水部分便相互吸引，缔合在一起，形成缔合体，即胶束，可触发从激发态裂解产物到荧 光表面活性剂之间的能量转移，因此可大幅度提高化学发光效率。
[0014] 其中，所述发光增强剂的结构式为以下的式（I)、式（II)、式（III)、式（IV)及 式（V)的其中一种：
[0015] (l)HOBEP-l:与香豆素类荧光化合物偶联
[0016]
[0017] (2)H0BEP_2 :与荧光素类荧光化合物偶联
[0018]
[0019] (3)H0BEP_3 :与萘酰亚胺类荧光化合物偶联
[0020]
[0021] (4)H0BEP_4 :与罗丹明类荧光化合物偶联
[0022]
[0023] (5)H0BEP_5 :与苯并咪唑类荧光化合物偶联
[0024]
[0025]其中，
[0026] &选自Ci_28烷基的其中一种；
[0027]R2选自以下取代基中的其中一种：卤素、羟基、疏基、氛基、硝基、烷基、烷氧基、齒 代烷基、氨基、烷基氨基、酰胺基；
[0028] n取5-10的整数。
[0029] 在具体实施例中，所述酶促化学发光底物还含有MgS04、ZnCl2及防腐剂。
[0030] 作为优选的【具体实施方式】，本发明的酶促化学发光底物以水为溶剂，含有以下组 分：
[0031]
[0032]
[0033] 在具体实施例中，所述防腐剂为ProClin300。
[0034] 本发明的碱性磷酸酶的酶促化学发光底物（APSH)的空白发光强度不高于200,检 测灵敏度达到l〇-19molAP。此外，将本发明的酶促化学发光底物分别于37°C放置10天， 4°C放置18个月进行稳定性研宄的结果表明，本发明提供的酶促化学发光底物（APSH)热稳 定性及实时稳定性均极好，能达到化学发光仪器检测的要求。总体而言，本发明提供的新型 化学发光底物（APSH)强度高，灵敏度高，持续时间长，可达30-60min，稳定性好，可完全满 足临床检测的需要，其主要性能指标已达到国外产品水平，大大降低了化学发光底物的成 本。
【附图说明】
[0035] 图1为实施例二的酶促化学发光底物（ASPH)及贝克曼化学发光底物（Access Substrate)在不同浓度AP条件下信号强度差异比较示意图。
[0036] 图2为实施例三的酶促化学发光底物（ASPH)反应动力学研宄实验结果示意图。
【具体实施方式】
[0037] 实施例一、酶促化学发光底物（APSH)的制备
[0038] ⑴材料：2_氨基-2-甲基-1-丙醇、AMPPD、MgS04及ZnCl2均为市售，化学纯； ProClin300为美国Supelco公司产品；发光增强剂H0BEP-1为通过脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸 钠与香豆素类荧光化合物偶联得到，发光增强剂H0BEP-2为通过脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠 与荧光素类荧光化合物偶联得到，发光增强剂H0BEP-3为通过脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与 萘酰亚胺类荧光化合物偶联得到，发光增强剂H0BEP-4为通过脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与 罗丹明类荧光化合物偶联得到，发光增强剂H0BEP-5为通过脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与苯 并咪唑类荧光化合物偶联得到。
[0039] (2)以超纯水为溶剂，按表1. 1，表1. 2,表1. 3分别制备最低高浓度、最佳浓度和最 低浓度的酶促化学发光底物APSH-1，按表2. 1，表2. 2,表2. 3分别制备最低高浓度、最佳浓 度和最低浓度的酶促化学发光底物APSH-2,按表3. 1，表3. 2,表3. 3分别制备最低高浓度、 最佳浓度和最低浓度的酶促化学发光底物APSH-3,按表4. 1，表4. 2,表4. 3分别制备最低高 浓度、最佳浓度和最低浓度的酶促底物化学发光底物APSH-4,按表5. 1，表5. 2,表5. 3分别 制备最低高浓度、最佳浓度和最低浓度的酶促化学发光底物APSH-5 :
[0040]表 1. 1APSH-1 的配方一
[0041]
[0042]表 1. 2APSH-1 的配方二
[0043]
[0044] 表1. 3APSH-1的配方三
[0045]
[0046]
[0047] 表2. 1APSH-2的配方一
[0048]
[0049] 表2. 2APSH-2的配方二
[0050]
[0051] 表2. 3APSH-2的配方三
[0052]
[0053] 表3. 1APSH-3的配方一
[0054]
[0055]
[0056] 表3. 2APSH-3的配方二
[0057]
[0058] 表3. 3APSH-3的配方三
[0059]
[0060] 表4. 1APSH-4的配方一
[0061]
[0062] 表4. 2APSH-4的配方二
[0063]
[0064] 表4. 3APSH-4的配方三
[0065]
[0066] 表5. 1APSH-5的配方一
[0067]
[0068] 表5. 2APSH-5的配方二
[0069]
[0070]
[0071] 表5. 3APSH-5的配方三
[0072]
[0073] 实施例二、比较本实施例酶促化学发光底物（APSH)与贝克曼化学发光底物 (AccessSubstrate)测试各梯度浓度AP信号强度及线性关系