一种高效检测禽肉中哌嗪残留的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种高效检测禽肉中哌嗪残留的方法。
【背景技术】
[0002] 目前国内外对哌嗪的残留检测方法主要有重量分析法、比色法、非水滴定法、气相 色谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法等。重量分析法、比色法和非水滴定 法不适合生物样品中哌嗪的检测，灵敏度较低。哌嗪无发光基团，不能直接被紫外检测器和 荧光检测器检测，需要进行衍生化反应使其携带发光基团，试验步骤繁琐，且衍生化产物不 稳定，所得数据误差较大。到目前为止，应用高效液相色谱法（HPLC)和高效液相色谱-串联 质谱法（HPLC-MS/MS)对猪组织、牛组织、鸡蛋、蜂蜜中哌嗪残留检测方法虽有报道，但检测 猪组织、牛组织、鸡蛋、蜂蜜和禽肉中哌嗪残留的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/ MS)的研宄尚未见报道。
【发明内容】
[0003] 为了能检测并确证哌嗪在禽肉中的残留，满足欧盟标准，本发明提供了一种超高 效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS)，能快速、高效地检测禽肉中哌嗪的残留。
[0004] 本发明所采用的技术方案是：一种高效检测禽肉中哌嗪残留的方法，是将禽肉经 过提取和净化后，超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS)检测。以0. 1 %甲酸水溶 液-甲醇为流动相，流速为0. 2mL/min，梯度洗脱，进样量为5. 0 μ L。采用电喷雾正离子模 式电离（ESI+)，多反应监测模式扫描（MRM)，外标法定量分析。
[0005] 所述的禽肉提取和净化是以5. 0%三氯乙酸水溶液和乙腈的混合溶液为提取剂处 理禽肉样品得提取液，提取液中加入乙腈饱和的正己烷去除脂肪后，用固相萃取法净化。具 体可采用下述操作：将禽肉样品均质后，加入5.0%三氯乙酸水溶液和乙腈混合溶液（体积 比3:1)振荡、混匀直接提取，离心，将上清液转移。重复提取1-2次，合并上清液，即得提取 液。
[0006] 向提取液中加入乙腈饱和的正己烷去除脂肪后，过混合阳离子固相萃取小柱 (Strata-X-C)，先依次用甲醇、超纯水、2. 0%甲酸水溶液将SPE小柱活化平衡，上样后待 提取液匀速流干后，再依次用2. 0%甲酸水溶液、超纯水、甲醇淋洗，待小柱干燥后，最终用 10.0%氨水乙腈进行洗脱。最后洗脱液用氮气吹干，上机前用2. OmL 20.0%甲醇水溶液涡 旋振荡溶解残渣，转移2. OmL复溶液至离心管中，常温离心10min，将上层清液过0. 22 μ m滤 膜，滤液供UPLC-MS/MS测定分析。
[0007] 本发明在回收率、精密度和灵敏度三个方面与其他检测方法进行比较，本方法具 有简单、快速、准确和灵敏的优点。
【附图说明】
[0008] 图1哌嗪的电喷雾一级质谱扫描图。
[0009] 图2哌嗪的电喷雾二级质谱扫描图。
[0010] 图3鸡肌肉中哌嗪的基质添加标准曲线。
[0011] 图4空白鸡肌肉的总离子流色谱图（TIC)和提取离子色谱图（XIC)。
[0012] 图5空白鸡肌肉样品添加1 μ g/kg (LOQ)标准品的总离子流色谱图（TIC)和提取 离子色谱图（XIC)。
【具体实施方式】
[0013] 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。
[0014] 下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为 了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0015] 在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相 同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
[0016] 本发明中所涉及到的溶液百分浓度，除特别说明外均为质量百分浓度。
[0017] 1.实验家禽的饲养和样品采集
[0018] 分别选取销往各活禽农贸市场和超市的上市日龄肉用家禽，即16周龄京海黄鸡、 10周龄扬州鹅和8周龄樱桃谷鸭各12羽，公、母各半，单笼饲养，饲喂不含任何药物的全价 饲料，自由饮水。饲养2周后屠宰时分别取两侧胸肌作为空白肌肉样品，-35°C保存，使用时 将该样品绞碎使之均质。
[0019] 2.本发明提取与净化步骤
[0020] 1)用粉碎机将禽肉均质；
[0021] 2)准确称取（2. 0±0. 02) g均质好的空白禽肉样品，置于50.0 mL聚丙烯带盖离心 管内；
[0022] 3)加入6. OmL 5. 0%三氯乙酸水溶液和2. OmL乙腈，涡旋混匀2min，水浴超声振荡 辅助萃取IOmin ;
[0023] 4)以12000\8,4°〇离心10111丨11，将上清液转移至另一50.01^离心管中；
[0024] 5)重复提取（6. OmL 5. 0 %三氯乙酸水溶液和2. OmL乙腈再次提取沉淀物，涡旋振 荡2111；[11，超声振荡辅助萃取10111；[11)，12000\〖，4<€离心10111；[11，合并两次上清液 ；
[0025] 6)向上清液中添加10.0 mL乙腈饱和的正己烧，涡旋振荡3min，6000Xg，4°C离心 5min，弃去上层正己烷，重复去脂一次，最终得到提取液；
[0026] 7)依次分别用3. OmL甲醇、3. OmL超纯水、3. OmL 2. 0%甲酸水溶液将混合阳离子 固相萃取小柱（Strata-X-C)活化；
[0027] 8)向活化后的固相萃取小柱中加入提取液，匀速流干；
[0028] 9)依次用3. OmL 2. 0%甲酸水溶液、3. OmL超纯水、3. OmL甲醇淋洗；
[0029] 10)待固相萃取小柱干燥后，用10.0 mL 10. 0%氨水乙腈洗脱至IOmL离心管中；
[0030] 11)将离心管置于干浴氮吹仪中，40°C氮气吹干；
[0031] 12)取2. OmL 20. 0%甲醇水溶液涡旋振荡溶解残渣，并转移至2. OmL具塞离心管 中；
[0032] 13) 12000\8，常温下离心101^11，上清液经0.22 4111滤膜过滤，滤液供诎^：-]^/]^ 测定。
[0033] 3试验条件
[0034] 3. 1液相色谱条件
[0035] 色谱柱！Waters ACQUITY UPLCk HSS T3,1. 8 μm，100.0 mmX2. Imm i. d.;保护 柱：ACQUITY UPLCk BHl C18,1. 7 μ m，2· I X 5mm i. d.;流动相：A 液为 0· I % (体积分数） 甲酸水溶液，B液为甲醇，梯度洗脱程序见表1 ;流速：0. 2mL/min ;柱温：35. (TC ;样品室温 度：4°C;进样体积：5. 0 μ L ;六通阀：0~I. 3min -质谱（B位），1. 3~4min -废液（A位）， 4~8min -质谱（B位）。
[0036] 表1梯度洗脱程序
[0037]
【主权项】
1. 一种高效检测禽肉中哌嗪残留的方法，其特征在于，将禽肉经过提取和净化后，用超 高效液相色谱-串联质谱法检测。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，超高效液相色谱-串联质谱的条件是：以 0. 1 %甲酸水溶液-甲醇为流动相，流速为0. 2mL/min，梯度洗脱，进样量为5. O y L ;采用电 喷雾正离子模式电离，多反应监测模式扫描，外标法定量分析。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的禽肉提取和净化是：以5. 0 %三氯 乙酸水溶液和乙腈的混合溶液为提取剂处理禽肉样品得提取液，提取液中加入乙腈饱和的 正己烷去除脂肪后，用固相萃取法净化。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的禽肉提取和净化具体步骤是：将禽 肉样品均质后，加入5. 0%三氯乙酸水溶液和乙腈混合溶液振荡、混匀直接提取，离心，将上 清液转移；重复提取1-2次，合并上清液，即得提取液； 向提取液中加入乙腈饱和的正己烷去除脂肪后，过混合阳离子固相萃取小柱 Strata-X-C，先依次用甲醇、超纯水、2. 0%甲酸水溶液将SPE小柱活化平衡，上样后待提 取液匀速流干后，再依次用2. 0 %甲酸水溶液、超纯水、甲醇淋洗，待小柱干燥后，最终用 10.0%氨水乙腈进行洗脱。最后洗脱液用氮气吹干，上机前用2. OmL 20.0%甲醇水溶液涡 旋振荡溶解残渣，转移2. OmL复溶液至离心管中，常温离心10min，将上层清液过0. 22 y m滤 膜，滤液供UPLC-MS/MS测定分析。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述5. 0%三氯乙酸水溶液和乙腈的混合 溶液，其中5. 0%三氯乙酸水溶液和乙腈的体积比为3 :1。
【专利摘要】本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种高效检测禽肉中哌嗪残留的方法。该方法是将禽肉经过提取和净化后，用超高效液相色谱-串联质谱法检测。本发明在回收率、精密度和灵敏度三个方面与其他检测方法进行比较，具有简单、快速、准确和灵敏的优点。
【IPC分类】G01N30-06, G01N30-02
【公开号】CN104807906
【申请号】CN201510228890
【发明人】谢恺舟, 孙礼瑞, 庞茂达, 王冉, 王剑锋, 崔璐璐, 刘建宇, 高强, 刘亚楠, 王波, 张跟喜, 戴国俊, 卜仕金, 王金玉
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月7日