碱性木聚糖酶活力测定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于木聚糖酶活力测定领域，具体涉及一种碱性木聚糖酶活力测定的方 法。
【背景技术】
[0002] 木聚糖酶是可将木聚糖降解为单糖和寡糖的水解酶。一直以来，其在造纸、食品、 饲料、能源等工业都有着较为重大的应用价值，因而引起科研工作者的广泛关注，并对其进 行了相关研宄。酶活力是衡量酶生物活力的重要指标。对于木聚糖酶活力的测定，已有既 定的国家标准GB 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定，然而该标准是在37°C、pH 为5. 50的条件下来进行测定。而对于很多工业而言，碱性的环境使得木聚糖酶的使用并非 十分便利。随着对木聚糖酶的研宄和发展，新型的碱性木聚糖酶正在相关行业中崭露头角。 由于传统的木聚糖酶活力测定方法是酸性方法，对于碱性木聚糖酶而言，酸性木聚糖酶的 检测条件和方法已经有所不足。酸性条件下的碱性木聚糖酶活力不是最佳，并且会对碱性 木聚糖酶活力造成降低，从而对碱性木聚糖酶的活力表示偏差很大。传统的测定方法已经 无法再客观地反应碱性木聚糖酶的活力，新的方法亟待出现。
【发明内容】
[0003] 本发明针对已有的技术的不足，提供一种碱性木聚糖酶活力测定的方法，该方法 能够更为客观地反应碱性木聚糖酶的活力。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] 碱性木聚糖酶活力测定的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)依据碱性木聚糖酶的特性，配制pH = 7. 8的磷酸二氢钠 -磷酸氢二钠缓冲液， 并在此基础上配制木糖标准溶液、木聚糖标准溶液及待测碱性木聚糖酶样品；
[0007] (2)制作木糖吸光度-木糖浓度的标准曲线，其斜率为K，截距为Cci;
[0008] (3)在pH = 7. 8的碱性环境下，用步骤⑴中待测碱性木聚糖酶样品水解木聚糖 为木糖，记录酶解反应时间t，并用紫外分光光度法检测水解得到的木糖的吸光度A e;同时 设置不加碱性木聚糖酶的空白对照组，并测其吸光度Ab;
[0009] (4)根据以下公式计算出碱性木聚糖酶活力XD:
[0011] 式中：
【主权项】
1. 碱性木聚糖酶活力测定的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 依据碱性木聚糖酶的特性，配制pH= 7. 8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，并在 此基础上配制木糖标准溶液、木聚糖标准溶液及待测碱性木聚糖酶样品； (2) 制作木糖吸光度-木糖浓度的标准曲线，其斜率为K，截距为 (3) 在pH= 7. 8的碱性环境下，用步骤（1)中待测碱性木聚糖酶样品水解木聚糖为木 糖，记录酶解反应时间t，并用紫外分光光度法检测水解得到的木糖的吸光度AE;同时设置 不加碱性木聚糖酶的空白对照组，并测其吸光度Ab; (4) 根据以下公式计算出碱性木聚糖酶活力XD:
式中： XD--稀释酶液中木聚糖酶的活力，U?ml/1; Ae一一酶反应液的吸光度； Ab一一酶空白样的吸光度； K--标准曲线的斜率； C〇--标准曲线的截距； M--木糖的摩尔质量，M(C5H1Q05) = 150. 2g?mol-1; t--酶解反应时间，min; 1000--转化因子，lmmol=1000 y mol〇
2. 根据权利要求1所述的碱性木聚糖酶活力测定的方法，其特征在于，步骤（1)所述 pH= 7. 8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液的配制过程如下：取磷酸氢二钠35. 90g，加水 溶解，并稀释至500mL，得到甲液；取磷酸二氢钠2. 76g，加水溶解，并稀释至100mL，得到乙 液；取91. 5mL甲液与8. 5mL乙液混合，摇匀，即得所述pH= 7. 8的磷酸二氢钠-磷酸氢二 钠缓冲液； 步骤（1)所述木糖标准溶液的配制过程如下：称取无水木糖1. 〇〇〇g，加pH= 7. 8的磷 酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解，定容至l〇〇mL，即得所述木糖标准溶液； 步骤（1)所述木聚糖标准溶液的配制过程如下：在50°C下，称取木聚糖1. 0000g，加 入0. 32g氢氧化钠，再加入90mL水，磁力搅拌，同时加热，直至木聚糖完全溶解；然后停止 加热，继续搅拌30min，加入1. 18g磷酸氢二钠；继续磁力搅拌，同时测定其pH;如果pH为 7. 80,用pH= 7. 8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100mL，如果pH偏离7. 80， 再用甲液或乙液调节至7. 80,然后再用pH= 7. 8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液定容 至100mL，得到所述木聚糖标准溶液； 步骤（1)所述碱性木聚糖酶样品的反应用酶液配制过程如下： 碱性木聚糖酶样品为固体样品的反应用酶液制备过程为：称样量称取试样两份，精确 至0? 001g，加入40mLpH= 7. 8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，磁力搅拌30min，再用 pH= 7. 8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100mL，在4。。条件下避光保存lh~ 2h，上离心机1000g离心3min~5min，取上清液，再用pH= 7. 8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠 缓冲溶液做适当稀释，稀释后的待测酶液中木聚糖酶活力控制在〇. 04U ~0. 10U?mL-1 之间； 碱性木聚糖酶样品为液体样品的反应用酶液制备过程为：液体样品直接用pH= 7. 8的 磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液进行稀释、定容，稀释后的酶液中木聚糖酶活力控制在 0. 04U?ml/1~0. 10U?mL之间；如果稀释后酶液的pH偏离7. 80,需要用甲液或乙液调节 校正至7. 80,然后再用pH= 7. 8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液做适当稀释定容。
3. 根据权利要求1所述的碱性木聚糖酶活力测定的方法，其特征在于，步骤（2)所述制 作木糖吸光度-木糖浓度标准曲线时，吸取步骤（1)配制的pH= 7. 8的磷酸二氢钠-磷酸 氢二钠缓冲溶液4.OOmL，加入DNS试剂5.OOmL，沸水浴加热5min，冷却至室温，用水定容至 25.OOmL，制成标准空白样。
4. 根据权利要求1所述的碱性木聚糖酶活力测定的方法，其特征在于，步骤（3)测定酶 活力的过程中，整个液体环境保持在50°C、pH= 7. 80条件下。
【专利摘要】本发明公开了一种碱性木聚糖酶活力测定的方法，属于木聚糖酶活力测定领域。所述方法包括以下步骤：配制pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，并在此基础上配制木糖标准溶液、木聚糖标准溶液及碱性木聚糖酶样品；制作木糖吸光度-木糖浓度的标准曲线；在pH＝7.8的碱性环境下，用待测碱性木聚糖酶水解木聚糖，并检测水解得到的木糖的吸光度AE；同时设置不加碱性木聚糖酶的空白对照组，并测其吸光度AB；将所测水解得到的木糖的吸光度值用标准曲线对应获得所述水解产物木糖的含量；根据公式计算出碱性木聚糖酶活力。本发明针对碱性木聚糖酶活力测定方法进行了改进，解决了现有检测方法不能客观地反应碱性木聚糖酶的活力的问题。
【IPC分类】G01N21-31, G01N1-28
【公开号】CN104807764
【申请号】CN201510191712
【发明人】马千里, 杨仁党, 杨飞, 阮蒙
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月21日