一种运用secm检测离子在质子响应的离子通道中的转移行为的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种运用SECM检测离子在质子响应的离子通道中的转移行为的方法，属于电分析化学领域。
【背景技术】
[0002]扫描电化学显微镜(ScanningElectrochemical Microscopy，SECM)由著名的电分析化学家Bard等结合扫描隧道显微镜(Scanning Tunnel Microscope, STM)和超微电极发展起来的一种新的电化学现场检测技术。SECM具有高的空间分辨率和化学灵敏性，不但可以研宄探头和基底之间溶液层中的均相反应动力学，还可以探宄探头、基底上的异相反应动力学，分辨电极表面微区的电化学不均匀性，对材料进行微加工。SECM研宄液/液界面过程的优点:
1、可以克服液/液界面间的iR降
2、可以区分电子转移(ET)和离子转移(IT)
3、充电电流较小
4、电位窗较宽过程
为了维持正常的生理功能，细胞需与外界不断地进行物质、能量交换，信号传递等，而这些过程与细胞膜上的离子通道息息相关。细胞所处的环境因素例如，pH、温度、水分、化学环境等不断发生着变化。细胞膜上的离子通道通过调节通道的开关控制物质进出细胞的速度来应对这些外场刺激的变化，这对实现细胞各种功能具有重要的意义。近年来，受生物离子通道的启发，各种人造的仿生纳米通道被开发用来模拟复杂的生物过程。相比于生物离子通道，这些人造纳米通道具有更好稳定性，更加适用于实际应用。
[0003]响应型纳米流体器件是在孔道表面修饰响应型分子，通过各种外场刺激(如:pH，温度，光等)来改变其电荷或孔尺寸来调控离子传输。
[0004]目前，多孔阳极氧化铝膜受到了越来越多的关注。其纳米孔道由六角形紧密堆积排列，孔径均匀，形貌和大小可控，最小孔径为4nm，大的孔径可达几百纳米，纳米孔密度每平方厘米可达到1011个，排布呈阵列式。多孔阳极氧化铝膜孔道与膜垂直，孔道之间相互独立，不会因为纳米孔道的倾斜而发生相互交错的情况。由此，可进一步通过修饰和组装制备各种功能纳米通道。它作为一种优良的生物亲和性纳米材料，其通道表面的羟基可以与多种官能团形成比较稳定的共价键，这极大的增强了氧化铝纳米通道的可修饰性和广泛应用。这种纳米通道通过化学修饰制备功能化单层自组装膜，在单分子分析、DNA检测、新型纳米生物传感器等生化分离分析新方法研宄中具有重要的意义和广阔的应用前景。
[0005]在氧化铝纳米通道表面用化学方法可以修饰有机分子:APTMS或氨基酸(赖氨酸，组氨酸)，利用在不同PH值溶液中，其表面荷电性质的差异调控了离子在限域环境中的转移，成功的构筑了 H+响应的离子通道。现有技术中，未见有关子可以检测在质子响应的离子通道中的转移行为的方法的报道。
[0006]目前，现有研宄离子转移的技术只能研宄水平的模拟界面上离子转移的动力学行为，不能研宄实际细胞膜上的离子转移过程，不能对界面上离子转移的形貌进行研宄。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种运用SECM检测离子在质子响应的离子通道中的转移行为的方法，利用SECM检测研宄离子在质子响应的离子通道中转移行为，以实现通过调控PH值达到调控离子转移的目的。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案:
一种运用SECM检测离子在质子响应的离子通道中的转移行为的方法，其特征在于，包括如下各步骤:
1)氧化铝模板的制备:利用两步阳极氧化法制备阳极氧化铝模板；
2)有机分子的组装:包括APTMS的组装或氨基酸的组装；
所述APTMS (3-氨丙基三甲氧基硅烷)的组装:将处理过后的阳极氧化铝模板浸泡到1ml APTMS浓度为10%的丙酮溶液中静置过夜，使AAO (阳极氧化铝模板)纳米通道内的羟基通过硅烷化反应键合上-NH2,先用丙酮清洗，再用二次蒸馏水清洗，待用；
所述组装氨基酸的方法:将处理过后的阳极氧化铝模板浸泡到1ml APTMS浓度为10%的丙酮溶液中静置过夜，使AAO (阳极氧化铝模板)纳米通道内的羟基通过硅烷化反应键合上-NH2,先用丙酮清洗，再用二次蒸馏水清洗，再在2.5%戊二醛溶液中静止过夜，二次蒸馏水清洗，干燥；制备循环装置:将pH为7.0的50mM氨基酸的PB缓冲液循环流过AAO模板，用PH为7.0的PB缓冲液清洗模板，待用；
3)将经过有机分子组装的AAO模板固定在塑料管上；
4)在电解池中先加入水相，再将固定有AAO的塑料管置于电解池中，再向塑料管中加入有机相，使AAO正好处于两互不相溶的水油界面处，构筑离子通道；
5)组装三电极体系，用SECM进行循环伏安曲线与反馈曲线的扫描；
6)在不同pH值条件下，AAO组装表面荷电性质的差异调控了离子在限域环境中的转移，即可检测离子的转移行为。
[0009]为了得到更好的阳极氧化铝模板，所述步骤I)中制备AAO时，阳极氧化电压优选为40V，第二次氧化时间优选为3h。
[0010]进一步地，所述步骤2)中组装的氨基酸包括组氨酸或赖氨酸。
[0011]本发明在组装氨基酸的步骤中，循环装置的作用是氨基酸通过流动循环液均匀的修饰在A A O的表面。
[0012]进一步地，所述步骤3)中使用的塑料管的管口半径r=2cm。
[0013]实验过程中，塑料管的管口半径可根据实验的要求设定，只要与实验电解池相匹配即可。
[0014]进一步地，所述步骤4)中使用的电解池为三岔管，固定有AAO的塑料管置于三岔管的主管处。
[0015]进一步地，所述三岔管事先硅烷化12小时。
[0016]进一步地，所述步骤5)中三电极体系使用的参比电极为覆盖着AgTPBCl的银丝。
[0017]进一步地，所述步骤5)中三电极体系使用的对电极为Pt丝。
[0018]进一步地，所述步骤5)中三电极体系使用的工作电极为微管支撑的电极，优选为毛细管微管电极为工作电极。
[0019]本实验的参比电机优选为覆盖着AgTPBCl的银丝，若用其他电极代替会造成C V的峰电位发生偏差。
[0020]本发明的三电极体系在工作时，参比电极和对电极均插入水相。油相和水相体积比为1: 1，均为0.3 mLo
[0021]本发明利用SECM进行循环伏安曲线与反馈曲线的扫描时，是在电化学工作站CHI900上完成循环伏安曲线和反馈曲线的扫描，电势扫描范围为1.6V到0.4V。
[0022]进一步地，所述步骤6)中AAO表面荷电性质的差异是由水相的pH调控的。
[0023]本发明的所有操作均在室温(20 ± 2 ) °(:下进行。
[0024]本发明先将有机硅烷组装在多孔阳极氧化铝(AAO)无机纳米孔内，构建了一种新型的无机有机仿生纳米膜，以及进一步对氨基酸(组氨酸，赖氨酸)组装的研宄。同时利用SECM手段研宄了离子在仿生纳米膜中的转移行为。利用在不同pH值条件下，氨基荷电性质的差异调控离子在限域环境中的转移。此法构筑了一种H+响应的离子通道的方法，能更好的研宄离子转移的动力学过程，这些研宄有助于我们更好地认识界面离子转移机理，认识生命过程中钾离子膜转移机理，对揭示生命奥密具有重要的意义。
【附图说明】
[0025]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是AAO表面组装APTMS，pH对离子转移的影响，为K+在界面转移循环伏安图，溶液pH从上到下分别是5.0，6.5，8.0 ;
图2是AAO表面组装APTMS，pH对离子转移的影响，为K+转移的SECM反馈曲线，溶液pH从上到下分别是5.0，6.5，8.0 ;
图3是AAO表面组装APTMS，离子强度对离子转移的影响，为K+在界面转移循环伏安图，离子强度变化分别从0.1 ~ 0.5 M，N15C5的浓度是I mM.扫速为50 mV/s ；
图4是AAO表面组装APTMS，离子强度对离子转移的影响，为K+转移的SECM反馈曲线，离子强度变化分别从0.1 ~ 0.5 M，N15C5的浓度是I mM.扫速为50 mV/s ；
图5是AAO表面组装APTMS，孔尺寸对离子转移的影响，为K+在界面转移循环伏安图，氧化销模板在5wt%的磷酸溶液中浸泡时间分别是1min, 20min, 30min, 40min ；
图6是AAO表面组装APTMS，孔尺寸对离子转移的影响，为K+转移的SECM反馈曲线，氧化销模板在5wt%的磷酸溶液中浸泡时间分别是1min, 20min, 30min, 40min ；
图7是氧化铝模板在5wt%的磷酸溶液中浸泡不同时间的扫描电镜图，其中a)浸泡O分、b)浸泡10分钟、c)浸泡20分钟、d)浸泡40分钟，浸泡温度为19 °C，标尺:100 nm。
【具体实施方式】
[0026]以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0027]实施例1:运用SECM检测离子在质子响应的离子通道中的转移行为的方法实验过程中使用的水均为二次蒸馏水(简称二次水)，实验所用的试剂均为分析纯。实验均在室温(20±2 ) tlC下进行。
[0028]一、本实施例所使用的仪器与试剂
a、微米管电极的制备
以玻璃毛细管(0.d.= 2.0 mm, 1.