-单磷酸钠相对含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学检测技术领域，具体涉及一种测定次黄苷与次黄苷-5' -单 磷酸钠相对含量的方法。
【背景技术】
[0002] 次黄苷-5' -单磷酸钠是酶化学法测定5' -核苷酸酶（5' -NT)的底物，以次黄 苷-5' -单磷酸钠为主要原料之一的液体型5' -NT测定试剂具有稳定、抗干扰能力好、能 实现自动化分析等特点，在临床得以广泛应用。次黄苷-5' _单磷酸钠在_20°C保存时具 有良好的稳定性，受潮、受热后易分解产生次黄苷，次黄苷-5'_单磷酸钠中次黄苷与次黄 苷-5' -单磷酸钠相对含量的高低显著影响5' -NT测定试剂的灵敏度与空白吸光度值，是控 制5' -NT测定试剂批间差不可忽视的实验因素之一。
[0003] 目前实验室测定次黄苷_5'_单磷酸钠样品中次黄苷与次黄苷-5' -单磷酸钠相对 含量时均采用高效液相色谱（HPLC)法，该法需要专用大型仪器，需要标准品做对照，检测 费时，检测时还需要使用有毒溶剂甲醇，易造成环境污染。
[0004] 因此，寻求一种操作简便、灵敏度高、结果准确的方法，对次黄苷_5' -单磷酸钠样 品中次黄苷与次黄苷-5' _单磷酸钠相对含量进行检测就显得尤为重要。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种测定次黄苷与次黄苷_5' _单磷酸钠相对含 量的方法，利用由嘌呤核苷磷酸化酶（PNP)、黄嘌呤氧化酶（XTO)、过氧化物酶（POD)组成 的酶偶联体系将次黄苷-5' _单磷酸钠样品中的次黄苷转化为紫红色醌衍生物并测定特定 波长下溶液吸光度值A1、加入含5' -核苷酸酶的缓冲液后继续反应一段时间后测定吸光度 值A2、利用A1值和A2值计算出黄苷-5' -单磷酸钠底物中次黄苷与黄苷-5' -单磷酸钠相对 含量。该法绿色、环保，无需校准品对照即可计算出次黄苷与黄苷-5' -单磷酸钠的相对含 量，并且用普通的可见分光光度计就可以实现检测。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0007] -种测定次黄苷与次黄苷-5' -单磷酸钠相对含量的方法，包括如下步骤：
[0008] 步骤 1、配制含有MgCl2、PNP、XTO、P0D、4-AAP、T00S、乙二醇、、蔗糖的pH7. 4-7. 8 磷酸氢二钾-磷酸二氢钾（K2HPO4-KH2PO4)缓冲液，得试剂A;
[0009] 步骤2、往步骤1所得的试剂A中加入含次黄苷和次黄苷-5' -单磷酸钠的待测样 品，在37°C环境中，反应3. 5-5min，直至样品中的次黄苷被转化为紫红色醌衍生物后，测定 540-560nm波长下的吸光度A1;
[0010] 步骤3、配制含5' -NT、乙二醇、蔗糖的pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04缓冲液，得试剂B;
[0011] 步骤4、将步骤3所得的试剂B加入到步骤2所得溶液中，在37°C环境中，继续反应 5-10min，直至样品中的次黄苷-5' -单磷酸钠被转化为紫红色醌衍生物后，测定540-560nm 波长下的吸光度A2;
[0012] 步骤5、通过以下公式计算出次黄苷与次黄苷-5' -单磷酸钠的相对含量：
[0013]样品液中次黄苷/次黄苷_5' -单磷酸钠（％) = (A1-Atl)X100%AA2-A1XV1Z^2)，
[0014] 式中，Atl为同体积的去离子水代替样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A1为样 品与试剂A反应所测得的吸光度值，A2为样品与试剂A反应后继续与试剂B反应所测得的 吸光度值，％为样品液和试剂A混合后的反应体积，V2为样品液与试剂A、试剂B混合后的 总反应体积
[0015] 作为优选，所述的步骤1中pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04缓冲液中K2即04-腿#04浓度 为 10-30mmol/L、MgCl2浓度为 20-50mmol/L、PNP浓度为 2-20KU/L、XTO浓度为 5-30KU/L、 POD的浓度为 10-50KU/L、4-AAP的浓度为 0? 2-5mmol/L、T00S的浓度为 0? 5-10mmol/L、乙二 醇浓度为10-lOOml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。
[0016] 作为优选，所述的步骤3中pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04缓冲液中K2即04-腿#04浓度 为 10-30mmol/L、5'-NT浓度为 20-200KU/L、乙二醇浓度为 10-lOOml/L、蔗糖浓度为 5-50g/ L0
[0017] 本发明具有以下有益效果：
[0018] 灵敏度高，线性、精密度好，结果准确，且操作简便快速，并可用于各种类型的分析 仪，达到大规模测定样本的要求。
【具体实施方式】
[0019] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0020] 实施例1
[0021] 精确称取0. 1克左右样品，用去离子水定容至样品终浓度为0.lg/L的样品液；配 制含有MgCl2 20mmol/L、PNP浓度为 2KU/L、XT0 浓度 5KU/L、P0D浓度为 10KU/L、4-AAP浓度 为0. 2mmol/L、T00S浓度为0. 5mmol/L、乙二醇浓度为10ml/L、鹿糖浓度为5g/L的10mmol/L pH7. 4K2HPO4-KH2PO4缓冲液为试剂A;配制含有5'-NT浓度为20KU/L、乙二醇浓度为IOml/ U蔗糖浓度为5g/L的lOmmol/LpH7. 4K2HPO4-KH2PO4缓冲液为试剂B。将试剂A和试剂 B用于测定样品液时，采用的仪器为奥林巴斯2700全自动生化分析仪，测定方法类型为终 点法，温度为37°C，V样品为3yI，300yI，V2为100y1，测定主/副波长为540/800nm， 试剂A加入样本后在测定温度反应3. 5分钟后读取吸光度A1，继续加入试剂B反应5分钟 后读取吸光度A2。样品液中次黄苷与次黄苷-5' -单磷酸钠相对含量的计算公式为：样品 液中次黄苷/次黄苷-5' -单磷酸钠（％) = (A1-Atl)X100%AA2-A1XVyV2)，其中Atl为同 体积的去离子水代替样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A1为样品与试剂A反应所测得 的吸光度值，A2为样品与试剂A反应后继续与试剂B反应所测得的吸光度值，V:为样品液 和试剂A混合后的反应体积，V2S样品液和试剂A、试剂B混合后的总反应体积。用本法和 HPLC法同时测定了 11例样品液中次黄苷与次黄苷-5' -单磷酸钠相对含量。
[0022] 表1为本实施例所述方法测定的结果与HPLC法测定测定结果对照表。
[0023]
【主权项】
1. 一种测定次黄苷与次黄苷-5' -单磷酸钠相对含量的方法，其特征在于，包括如下步 骤： 步骤 1、配制含有MgCl2、PNP、XTO、P0D、4-AAP、TOOS、乙二醇、、蔗糖的pH7. 4-7. 8 磷酸 氢二钾-磷酸二氢钾（K2HPO4-KH2PO4)缓冲液，得试剂A; 步骤2、往步骤1所得的试剂A中加入含次黄苷和次黄苷-5' -单磷酸钠的待测样品， 在37°C环境中，反应3. 5-5min，直至样品中的次黄苷被转化为紫红色醌衍生物后，测定 540-560nm波长下的吸光度A1; 步骤3、配制含5' -NT、乙二醇、蔗糖的pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04缓冲液，得试剂B; 步骤4、将步骤3所得的试剂B加入到步骤2所得溶液中，在37°C环境中，继续反应 5-10min，直至样品中的次黄苷-5' -单磷酸钠被转化为紫红色醌衍生物后，测定540-560nm 波长下的吸光度A2; 步骤5、通过以下公式计算出次黄苷与次黄苷-5' -单磷酸钠的相对含量： 样品液中次黄苷/次黄苷-5' _单磷酸钠（％) = (A1-Atl)X100%AA2-A1XV1A2)， 式中，Atl为同体积的去离子水代替样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A1S样品与 试剂A反应所测得的吸光度值，A2为样品与试剂A反应后继续与试剂B反应所测得的吸光 度值，％为样品液和试剂A混合后的反应体积，V2为样品液与试剂A、试剂B混合后的总反 应体积。
2. 根据权利要求1所述的一种测定次黄苷与次黄苷-5' -单磷酸钠相对含量的方法， 其特征在于，所述的步骤1中pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04缓冲液中K2HP04-KH2P04浓度为 10-30mmol/L、MgCl2浓度为 20-50mmol/L、PNP浓度为 2-20KU/L、XTO浓度为 5-30KU/L、POD 的浓度为 10-50KU/L、4-AAP的浓度为 0. 2-5mmol/L、TOOS的浓度为 0. 5-10mmol/L、乙二醇 浓度为l〇-l〇〇ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。
3. 根据权利要求1所述的一种测定次黄苷与次黄苷-5' -单磷酸钠相对含量的方法， 其特征在于，所述的步骤3中pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04缓冲液中K2HP04-KH2P04浓度为 10-30mmol/L、5'-NT浓度为 20-200KU/L、乙二醇浓度为 10-lOOml/L、蔗糖浓度为 5-50g/L。
【专利摘要】本发明公开了一种测定次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量的方法，利用由嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶组成的酶偶联体系将次黄苷-5'-单磷酸钠样品中的次黄苷转化为紫红色醌衍生物并测定特定波长下溶液吸光度值A1、加入含5'-核苷酸酶的缓冲液后继续反应一段时间后测定吸光度值A2、利用A1值和A2值计算出黄苷-5'-单磷酸钠底物中次黄苷与黄苷-5'-单磷酸钠相对含量，绿色、环保，无需校准品对照即可计算出次黄苷与黄苷-5'-单磷酸钠的相对含量，并且用普通的可见分光光度计就可以实现检测，灵敏度高，线性、精密度好，结果准确，且操作简便快速，并可用于各种类型的分析仪，达到大规模测定样本的要求。
【IPC分类】G01N21-31
【公开号】CN104764703
【申请号】CN201510185429
【发明人】潘利琴
【申请人】温州市人民医院
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月18日