一种测定待测样品中次黄苷与腺苷相对含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学检测技术领域，具体涉及一种测定腺苷样品中次黄苷与腺苷 相对含量的方法。
【背景技术】
[0002] 腺苷是酶化学法测定腺苷脱氨酶（ADA)的底物，以腺苷为主要原料之一的液体型 ADA测定试剂具有稳定、抗干扰能力好、能实现自动化分析等特点，在临床得以广泛应用。腺 苷在-20°C保存时具有良好的稳定性，受潮、受热后易分解产生次黄苷，腺苷中次黄苷与腺 苷相对含量的高低显著影响ADA测定试剂的灵敏度与空白吸光度值，是控制ADA测定试剂 批间差不可忽视的实验因素之一。
[0003] 目前实验室测定腺苷样品中次黄苷与腺苷相对含量时均采用高效液相色谱 (HPLC)法，该法需要专用大型仪器，需要标准品做对照，检测费时，检测时还需要使用有毒 溶剂甲醇，易造成环境污染。
[0004] 因此，寻求一种操作简便、灵敏度高、结果准确的方法，对腺苷样品中次黄苷与腺 苷相对含量进行检测就显得尤为重要。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种测定待测样品中次黄苷与腺苷相对含量的方 法，利用由嘌呤核苷磷酸化酶（PNP)、黄嘌呤氧化酶（XTO)、过氧化物酶（POD)组成的酶偶 联体系将腺苷样品中的次黄苷转化为紫红色醌衍生物并测定特定波长下溶液吸光度值4、 加入含腺苷脱氨酶的缓冲液后继续反应一段时间后测定吸光度值^、利用A 1值和A2值计算 出腺苷底物中次黄苷与腺苷相对含量。该法绿色、环保，无需校准品对照即可计算出次黄苷 与腺苷的相对含量，并且用普通的可见分光光度计就可以实现检测。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0007] -种测定待测样品中次黄苷与腺苷相对含量的方法，包括如下步骤：
[0008] 步骤 1、配制含有 MgCl2、EDTA · 2Na、Na2HP04、PNP、XTO、P0D、4-AAP、T00S、乙二醇、 蔗糖的pH 7. 0-7. 5三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCL)缓冲液，得试剂A ;
[0009] 步骤2、往步骤1所得的试剂A中加入含次黄苷和腺苷的待测样品，在37°C环境 中，反应5-10min，直至样品中的次黄苷被转化为紫红色醌衍生物后，测定540-560nm波长 下的吸光度A 1;
[0010] 步骤3、配制含ADA、乙二醇、蔗糖的ρΗ7· 0-7. 5Tris-HCL缓冲液，得试剂B ;
[0011] 步骤4、将步骤3所得的试剂B加入到步骤2所得溶液中，在37°C环境中，继续反 应5-10min，直至样品中的腺苷被转化为紫红色醌衍生物后，测定540-560nm波长下的吸光 度A2;
[0012] 步骤5、通过以下公式计算出次黄苷与腺苷的相对含量：
[0013] 样品液中次黄苷/腺苷（％) = (A1-Atl) X 100% AA2-A1XVyV2)，式中：Atl为同体 积的去离子水代替样品与试剂A反应所测得的吸光度值;A1为样品与试剂A反应所测得的 吸光度值;A2为样品与试剂A反应后继续与试剂B反应所测得的吸光度值；V i为样品液和 试剂A混合后的反应体积；V2S样品液与试剂A、试剂B混合后的总反应体积。
[0014] 优选的，所述的步骤1中ρΗ7· 0-7. 5Tris-HCL缓冲液中Tris-HCL浓度为 20-200mmol/L、MgCl2浓度为 l-25mmol/L、EDTA · 2Na 浓度为 0· 5-20mmol/L、Na 2ΗΡ04浓度为 5-50mmol/L、PNP 浓度为 0· 1-10KU/L、XTO 浓度为 0· 2-20KU/L、POD 的浓度为 0· 5-50KU/L、 4-AAP 的浓度为 0. 2-5mmol/L、T00S 的浓度为 0. 5-10mmol/L、乙二醇浓度为 10-100ml/L、蔗 糖浓度为5-50g/L。
[0015] 优选的，所述的步骤3中pH7. 0-7. 5Tri s-HCL缓冲液Tris-HCL浓度为 20-200mmol/L、ADA 浓度为 10-100KU/L、乙二醇浓度为 10-100ml/L、蔗糖浓度为 5-50g/L。
[0016] 本发明具有以下有益效果：
[0017] 灵敏度高，线性、精密度好，结果准确，且操作简便快速，并可用于各种类型的 分析仪，达到大规模测定样本的要求。
【具体实施方式】
[0018] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0019] 实施例1
[0020] 精确称取0. 1克左右样品，用去离子水定容至样品终浓度为0. 05g/L的样品液； 配制含有 MgCl2lmmol/L、EDTA · 2Na 浓度为 0. 5mmol/L、Na2HPO4浓度为 5mmol/L、PNP 浓度 为 0· 1KU/L、XT0 浓度 0· 2KU/L、P0D 浓度为 0· 5KU/L、4-AAP 浓度为 0· 2mmol/L、T00S 浓度为 0. 5mmol/L、乙二醇浓度为10ml/L、鹿糖浓度为5g/L的20mmol/LpH7. OTris-HCL缓冲液为 试剂1 ;配制含有ADA浓度为10KU/L、乙二醇浓度为10ml/L、蔗糖浓度为5g/L的20mmol/L pH 7. OTris-HCL缓冲液为试剂2。将试剂1和试剂2用于测定样品液时，采用的仪器为奥 林巴斯2700全自动生化分析仪，测定方法类型为终点法，温度为37°C，V #品为5 μ 1，V $ 300 μ 1，V 2为100 μ 1，测定主/副波长为540/800nm，试剂1加入样本后在测定温度反应 3. 5分钟后读取吸光度A1，继续加入试剂2反应5分钟后读取吸光度A2。样品液中次黄苷与 腺苷相对含量的计算公式为：样品液中次黄苷/腺苷（％) = (A1-Atl) X 100% AA2-A1XV1/ V2)，其中Atl为同体积的去离子水代替样品与试剂1反应所测得的吸光度值，A i为样品与试 剂1反应所测得的吸光度值，A2为样品与试剂1反应后继续与试剂2反应所测得的吸光度 值，％为样品液和试剂1混合后的反应体积，V 2为样品液和试剂1、试剂2混合后的总反应 体积。用本法和HPLC法同时测定了 11例样品液中次黄苷与腺苷相对含量。
[0021] 表2为本实施例所述方法测定的结果与HPLC法测定测定结果对照表。
[0022] 表 2
[0023]
【主权项】
1. 一种测定待测样品中次黄苷与腺苷相对含量的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤 1、配制含有MgCl2、EDTA? 2Na、Na2HP04、PNP、XTO、P0D、4-AAP、TOOS、乙二醇、蔗糖 的pH7. 0-7. 5三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCL)缓冲液，得试剂A; 步骤2、往步骤1所得的试剂A中加入含次黄苷和腺苷的待测样品，在37°C环境中，反 应5-10min，直至样品中的次黄苷被转化为紫红色醌衍生物后，测定540-560nm波长下的吸 光度A1; 步骤3、配制含ADA、乙二醇、蔗糖的pH7. 0-7. 5Tris-HCL缓冲液，得试剂B; 步骤4、将步骤3所得的试剂B加入到步骤2所得溶液中，在37°C环境中，继续反应 5-10min，直至样品中的腺苷被转化为紫红色醌衍生物后，测定540-560nm波长下的吸光度 A2; 步骤5、通过以下公式计算出次黄苷与腺苷的相对含量： 样品液中次黄苷/腺苷（％) = (A1-Atl)X100%AA2-A1XV1A2)，式中：Atl为同体积的 去离子水代替样品与试剂A反应所测得的吸光度值;A1为样品与试剂A反应所测得的吸光 度值;A2为样品与试剂A反应后继续与试剂B反应所测得的吸光度值；V:为样品液和试剂A 混合后的反应体积；％为样品液与试剂A、试剂B混合后的总反应体积。
2. 根据权利要求1所述的一种测定待测样品中次黄苷与腺苷相对含量的方法，其特 征在于，所述的步骤1中pH7. 0-7. 5Tris-HCL缓冲液中Tris-HCL浓度为20-200mmol/L、 MgCl2浓度为l-25mmol/L、EDTA? 2Na浓度为 0? 5-20mmol/L、Na2HP04浓度为 5-50mmol/L、 PNP浓度为 0. 1-10KU/L、XT0 浓度为 0. 2-20KU/L、P0D的浓度为 0. 5-50KU/L、4-AAP的浓度为 0. 2-5mmol/L、TOOS的浓度为 0. 5-10mmol/L、乙二醇浓度为 10-100ml/L、鹿糖浓度为 5_50g/ L0
3. 根据权利要求1所述的一种测定待测样品中次黄苷与腺苷相对含量的方法，其特征 在于，所述的步骤3中pH7. 0-7. 5Tris-HCL缓冲液Tris-HCL浓度为20-200mmol/L、ADA浓 度为10-100KU/L、乙二醇浓度为10-lOOml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。
【专利摘要】本发明公开了一种测定待测样品中次黄苷与腺苷相对含量的方法,利用由嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、黄嘌呤氧化酶(XTO)、过氧化物酶(POD)组成的酶偶联体系将腺苷样品中的次黄苷转化为紫红色醌衍生物并测定特定波长下溶液吸光度值A1、加入含腺苷脱氨酶的缓冲液后继续反应一段时间后测定吸光度值A2、利用A1值和A2值计算出腺苷底物中次黄苷与腺苷相对含量。该法绿色、环保，无需校准品对照即可计算出次黄苷与腺苷的相对含量，并且用普通的可见分光光度计就可以实现检测。本发明灵敏度高,线性、精密度好,结果准确,且操作简便快速,并可用于各种类型的分析仪，达到大规模测定样本的要求。
【IPC分类】G01N1-28, G01N21-31
【公开号】CN104730017
【申请号】CN201510186267
【发明人】连国军
【申请人】温州医科大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月18日