一种快速纯化糖化白蛋白粗溶液的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于白蛋白提纯技术领域，具体涉及一种快速纯化糖化白蛋白粗溶液的方 法。
【背景技术】
[0002] 糖化白蛋白（GA)由血液中的葡萄糖与白蛋白分子N未端发生非酶促糖化反应形 成，糖化血清白蛋白的测定可有效反映患者过去2~3周内平均血糖水平，而且不受当时血 糖浓度的影响，是糖尿病病人血糖控制的良好指标。糖化氨基酸氧化酶（FAOD)比色法是目 前测定GA的主要方法，在该方法中，需要不含糖化多肽、糖化氨基酸、葡萄糖的糖化白蛋白 溶液作为标准液和质控液进行对照测试和质量控制。在实验室中，糖化白蛋白粗溶液可以 通过将葡萄糖和白蛋白在水相混合、经过7~30天的糖基化反应获得，此粗溶液中含有较 多的糖化多肽、糖化氨基酸、葡萄糖等杂质，需要通过合适的方法进行纯化处理以去除上述 杂质。选择孔径适宜的半透膜对糖化白蛋白粗溶液进行2~4天的透析纯化是一种常规的 纯化方法，尽管在理论上采用足够长时间透析的方法可以去除糖化多肽、糖化氨基酸、葡萄 糖，但在长时间透析过程中有部分糖化白蛋白分解产生了糖化多肽和糖化氨基酸，使得透 析纯化后的糖化白蛋白溶液中依然有少量糖化多肽和糖化氨基酸存在，这些物质参与FAOD 比色法的显色反应，使FAOD比色法与参考方法HPLC法的GA测定值之间存在一定偏差。
[0003] 因此，需求一种快速纯化糖化白蛋白粗溶液的方法，以去除糖化白蛋白粗溶液中 的糖化多肽、糖化氨基酸、葡萄糖，就显得尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术检测糖化白蛋白存在的技术缺陷，目的在于提供一种快速纯 化糖化白蛋白粗溶液的方法，以去除糖化白蛋白粗溶液中的糖化多肽、糖化氨基酸、葡萄 糖。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] 一种快速纯化糖化白蛋白粗溶液的方法，其主要通过以下步骤完成：
[0007] 1)将待纯化的糖化白蛋白粗溶液离心分离IOmin后取上清溶液；
[0008] 2)将所取上清溶液移至切向流过滤系统，选择中空纤维膜组件、泵速和剪切力，进 行浓缩操作，在30min内将溶液浓缩到设定的浓缩倍数，获得粗浓缩糖化白蛋白溶液；
[0009] 3)选择中空纤维膜组件、泵速和剪切力，在切向流系统内对获得的粗浓缩糖化白 蛋白溶液进行洗脱操作，在60min内用缓冲液洗脱至设定的洗脱倍数；
[0010] 4)用糖化白蛋白稀释液将纯化后的糖化白蛋白溶液稀释至指定体积，测定糖化白 蛋白含量。
[0011] 进一步，
[0012] 步骤（1)中离心条件为：2~8°C，3000~8000rpm。
[0013] 步骤（2)中所述的中空纤维膜组件由中空纤维膜过滤器和超滤膜组成，超滤膜设 置在中空纤维膜过滤器内部，超滤膜为改性聚醚砜膜，截留分子量为60KD，膜面积为20~ 790cm2;所述的泵速为20~50ml/min ;所述的剪切力为2000~4000s、所述的浓缩倍数为 5~10倍。
[0014] 步骤（2)中所述的浓缩操作为：将需纯化的糖化白蛋白溶液装入样品容器，关闭 过滤回路的滤过液夹，调节泵速至目标流速的一半后开启蠕动泵，使糖化白蛋白溶液充满 整个过滤管路，直至过滤管路的回流液端有液体流出，关闭蠕动泵；将泵速调整至目标值， 开启过滤回路的滤过液夹，调节过滤回路的背压阀，使跨膜压恒定在3. OPsi，当达到设定的 浓缩倍数时关闭蠕动泵。
[0015] 步骤（3)中所述的中空纤维膜组件由中空纤维膜过滤器和超滤膜组成，超滤膜设 置在中空纤维膜过滤器内部，超滤膜为改性聚醚砜膜，截留分子量为60KD，膜面积为115~ 2600cm2 ;所述的泵速为50~80ml/min ;所述的剪切力为3000~6000s-1;所述的洗脱倍数 为5~10倍；所述的缓冲液为pH 7. 0~8. 0磷酸盐缓冲液，其浓度20~80mmol/L。
[0016] 步骤（3)中所述的洗脱操作为：将洗脱用的缓冲液装入清洗液容器，关闭过滤回 路的滤过液夹，调节泵速至目标流速的一半后开启蠕动泵，使糖化白蛋白溶液充满整个过 滤管路，直至过滤管路的回流液端有液体流出，关闭蠕动泵；将泵速调整至目标值，开启过 滤回路的滤过液夹，调节过滤回路的背压阀，使跨膜压恒定在2. 5Psi，当达到设定的洗脱倍 数时关闭蠕动泵。
[0017] 步骤⑷中所述的糖化白蛋白稀释液为含有9g/L的氯化钠、0. 5~5mmol/L的 EDTA、0. 2-2g/L的叠氮钠、20~80mmol/L的pH7. 0~8. 0磷酸盐缓冲液。
[0018] 本发明的原理为：第一步，通过低温离心的方法去除糖化白蛋白粗溶液中可能含 有的悬浮性杂质，取上清液备用。第二步，将第一步制备的上清液转移至切向流过滤系统， 选择合适的中空纤维膜组件、泵速、剪切力，进行浓缩操作。此步骤通过将糖化白蛋白粗溶 液浓缩至一定体积，缩短后续洗脱操作所需要的时间，通过控制剪切力的大小避免糖化白 蛋白在浓缩过程中的分解，可在30分钟内去除糖化白蛋白粗溶液中大部分糖化多肽、糖化 氨基酸、葡萄糖。第三步，在切向流系统内对第二步所获得的粗浓缩糖化白蛋白溶液进行洗 脱操作，在60分钟内用缓冲液洗脱至设定的洗脱倍数。此步骤通过控制剪切力的大小避免 糖化白蛋白在洗脱过程中的分解，通过洗脱倍数的设定在60分钟内洗脱去除糖化多肽、糖 化氨基酸、葡萄糖，达到纯化糖化白蛋白的目的。第四步，用糖化白蛋白稀释液将纯化后的 糖化白蛋白溶液稀释至指定体积，用FAOD比色法和HPLC法分别测定GA含量。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0020] 糖化白蛋白粗溶液的制备：配制含有氯化钠的浓度为9g/L、EDTA浓度为5mmol/L、 叠氮钠的浓度为I. 〇g/L、葡萄糖的浓度为20g/L的50mmol/L pH 7. 5磷酸盐缓冲液1000ml， 加入重组人血清白蛋白20克使其浓度为20g/L，在37°C水浴中糖基化反应72小时。
[0021] 实施例1
[0022] -种快速纯化糖化白蛋白粗溶液的方法，包括以下步骤：
[0023] 1)将50ml待纯化的糖化白蛋白粗溶液置冷冻离心机中，选择离心温度为2°C，离 心转速为3000rpm，离心10分钟后取上清溶液49ml ;
[0024] 2)将步骤（1)所制备的49ml上清溶液转移至切向流过滤系统的样品容器中，将 超滤膜设置在中空纤维膜过滤器内部，超滤膜为改性聚醚砜膜，截留分子量为60KD，膜面积 为20cm 2，设置目标泵速为20ml/min，剪切力为2000s'关闭过滤回路的滤过液夹，先调节 泵速至目标流速的一半（lOml/min)，开启蠕动泵，使糖化白蛋白溶液充满整个过滤管路，直 至过滤管路的回流液端有液体流出，关闭蠕动泵；将泵速调整至目标值（20ml/min)，开启 过滤回路的滤过液夹，调节过滤回路的背压阀，使跨膜压恒定在3. OPsi，在达到5倍的浓缩 倍数时关闭蠕动泵，得到9. 8ml粗浓缩糖化白蛋白溶液，总需时18分钟。
[0025] 3)将膜面积为115cm2的超滤膜设置在中空纤维膜过滤器内部，超滤膜为改性聚醚 砜膜，截留分子量为60KD，设置目标泵速为50ml/min，剪切力为3000s- 1。将洗脱用的49ml 浓度为20mmol/L的pH 7. 0磷酸盐缓冲液装入清洗液容器，关闭过滤回路的滤过液夹，调节 泵速至目标流速的一半（25ml/min)，开启蠕动泵，使糖化白蛋白溶液充满整个过滤管路，直 至过滤管路的回流液端有液体流出，关闭蠕动泵；将泵速调整至目标值（50ml/min)，开启 过滤回路的滤过液夹，调节过滤回路的背压阀，使跨膜压恒定在2. 5Psi，当达到5倍的洗脱 倍数时关闭蠕动泵，总需时20分钟；
[0026] 4)收集步骤（3)纯化后的糖化白蛋白溶液9. 8ml，用含有氯化钠浓度为9g/L、EDTA 浓度为〇. 5mmol/L、叠氮钠浓度为0. 2g/L、pH 7. 0磷酸盐缓冲液浓度为20mmol/L的糖化 白蛋白稀释液稀释至500ml，用FAOD比色法和HPLC法测得GA浓度为分别为185 ymol/L、 183 μ mol/L，两者显不了很好的一致性。
[0027] 实施例2
[0028] -种快速纯化糖化白蛋白粗溶液的方法，