一种免疫磁珠阴性富集法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于癌症诊断技术领域，尤其涉及一种免疫磁珠阴性富集法及应用。
【背景技术】
[0002]肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，据WHO统计，每年全世界估计有130万人死于肺癌，其中85%为非小细胞肺癌。肺癌患者的平均生存期约10个月，其5年生存率不足15%。尽管近年来肿瘤分子生物学研宄的进展及新的化疗药物的应用为肺癌的诊断和治疗带来了新的希望，但大部分肺癌患者的生存率并无明显改善。肺癌的转移、复发及对化疗药物的耐药仍是目前面临的难题。胸腔积液是肺癌的常见症状之一，也是许多患者的首发表现，但是胸腔积液亦常见于其他非肿瘤性疾病，如结核、肺炎及心功能不全等。
[0003]目前胸腔积液肿瘤细胞富集方法常用的梯度密度离心法，但敏感性较低，约为42?67%，容易漏诊。目前最新的免疫磁珠技术主要用于细胞的分离和纯化，包括免疫磁珠阳性捕获法和阴性富集法，常用于外周血循环中肿瘤细胞(circulating tumor cels,CTC)的富集。但免疫磁珠阳性法富集检测肿瘤细胞需要特异性的肿瘤细胞抗体，不仅成本较高，对于部分不表达特异性抗体或抗原抗体难以结合的肿瘤细胞容易漏诊，造成假阴性；并且经抗体抗原反应后，肿瘤细胞的生物学特性会受到一定影响，从而影响其后续生物学特性分析的准确性。
[0004]因此迫切需要一种敏感性和特异性俱佳的实验技术来协助恶性胸腔积液的诊断。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种免疫磁珠阴性富集法及应用，旨在解决现有肺癌诊断技术敏感性和特异性欠佳的问题。
[0006]本发明是这样实现的，一种免疫磁珠阴性富集法，包括以下步骤:
[0007](I)将预处理后的1ml胸水标本和1ml腹水标本加入离心管A中，竖直摇匀细胞后，配平，室温600g离心3分钟，弃上清至3ml，再加入2ml I X hCTC缓冲液，摇匀细胞；
[0008](2)将3ml hCTC非血源性细胞分离介质加入到离心管B，再将离心管A中的细胞液转移到离心管B中分离介质顶层，将离心管B用hCTC缓冲液配平后，在室温400g离心5分钟；将离心管B中底层沉积红细胞上的所有液体分别转移至离心管C中；
[0009](3)在摇动状态下，按每管80 μ I的比例将洗涤后的磁珠缓慢加入离心管C中，再将离心管以35?40°倾斜固定于摇床上，室温120rpm摇动10分钟；
[0010](4)将3ml hCTC非血源性细胞分离介质加入离心管D中，再将离心管C中的磁珠悬液加到离心管D中分离介质顶层，将离心管D用hCTC缓冲液配平后，在室温400g离心5分钟；将离心管D中底层沉积磁珠上的所有液体转移至离心管E中；
[0011](5)将14ml I XhCTC缓冲液加入离心管E中，使用I XhCTC缓冲液配平后，头尾颠倒混匀，室温950g离心3分钟；弃上清至300 μ I，加入1.4ml I XhCTC缓冲液，混匀，将液体转移至离心管F中；
[0012](6)将离心管F置于磁力架上吸附磁珠，两分钟后轻轻吹打、旋转液体，三分钟后将离心管F内的液体转移至离心管G中；
[0013](7)将14ml I XhCTC缓冲液加入到离心管G中，将离心管G中液体吹打三次，再用I XhCTC缓冲液配平后，头尾颠倒混匀，室温950g离心3分钟，弃上清；
[0014](8)将离心管G中的细胞进行计数、稀释后，加入100 μ I Cytelligen固定液混匀，将离心管G中液体涂片、干燥后进行检测。
[0015]优选地，在步骤(I)中，所述预处理为:将采集的1ml胸水标本和1ml腹水标本分别与Iml细胞保存液混合摇匀，4°C避光保存，且标本待用时间不超过24小时。
[0016]优选地，在步骤⑵中，所述将离心管A中的细胞液转移到离心管B中分离介质顶层具体为:将管A中的细胞液沿管壁液面处位置缓慢加到离心管B中分离介质顶层。
[0017]优选地，在步骤(6)中，所述轻轻吹打、旋转液体具体为:用Iml枪头沿磁珠对侧管壁轻轻吹打液体I?2次，并旋转离心管15°。
[0018]优选地，在步骤(8)中，所述计数、稀释具体为:
[0019]将100 μ I细胞液混匀后，取4 μ I细胞液于4 μ I 2 %冰醋酸中，混匀，将以上8 μ I液体于血细胞计数板上观察四个大方格中的细胞总数；
[0020]当四个大方格中的细胞数多于100个时，按比例将细胞液稀释至四个大方格中的细胞总数为100个以内。
[0021]优选地，在步骤(8)中，所述干燥具体为:将标本放置30?32°C干燥箱过夜，干燥箱全程不开鼓风，打开顶置通风口，第二天关闭干燥箱温度后将标本继续静置于干燥箱中30分钟凉至室温，立即进行后续检测。
[0022]优选地，在步骤(8)中，所述检测包括FISH检测。
[0023]有优选地，所述离心管A?G的规格分别为50ml、50ml、50ml、50ml、15ml、2ml、15ml o
[0024]本发明进一步提供了上述免疫磁珠阴性富集法在肺癌诊疗中的应用。
[0025]优选地，所述应用具体包括:
[0026](I)对捕获合并恶性胸腔积液的NSCLC患者治疗前、治疗中、治疗后的胸水肿瘤细胞进行肿瘤细胞计数；
[0027](2)对捕获的肿瘤细胞采用免疫荧光及流式细胞术检测细胞表面CD133、CK表达、倍体分析、端粒酶活性检测、肿瘤细胞侵袭及转移能力；
[0028](3)收集入组NSCLC患者临床资料，将肿瘤细胞计数、⑶133、CK表达、倍体分析、端粒酶活性、肿瘤细胞侵袭、转移能力与肺癌患者耐药、疗效及预后分析。
[0029]免疫磁珠阴性富集法起初用于外周血循环中肿瘤细胞的富集及检测，其敏感性及特异性均较高，原理是通过免疫磁珠技术去除无关细胞而使目标细胞得以纯化，从而提高外周血循环中肿瘤细胞的检测率；并且阴性法富集后的肿瘤细胞纯度较高，且没有被抗体触及而处于自然状态，从而可进行一系列后续分析测定。本发明克服现有技术的不足，首次将免疫磁珠阴性富集法用于恶性胸腔积液中肿瘤细胞的富集，提高了肿瘤细胞检出的敏感性，与此同时，与外周血阴性富集法不同之处在于，由于正常外周血中不存在上皮来源的细胞，故上皮来源的肿瘤细胞分离及鉴定较为容易，而胸腔积液中因有大量的上皮和间皮细胞，大大影响了上皮来源肿瘤细胞的检出及鉴定，本发明免疫磁珠阴性富集法对此做了很大的改进，并联合FISH检测成功解决了上述难题，为肺癌诊疗提供极大帮助。本发明去除了胸腔积液中白细胞对肿瘤细胞端粒酶活性检测的影响，提高了胸腔积液中端粒酶活性对肺癌诊疗的敏感性、特异性及应用价值。
【附图说明】
[0030]图1是本发明实施例中恶性胸腔积液肿瘤细胞瑞姬染色涂片；其中，图①，②为密度梯度离心法富集后瑞姬染色细胞涂片(其中杂细胞较多，肿瘤细胞易聚集成团)；图③，④为免疫磁珠阴性富集法富集后瑞姬染色细胞涂片)；
[0031]图2是本发明实施例中恶性胸腔积液肿瘤细胞免疫磁珠阴性富集后7、8号染色体着丝粒FISH分析图；其中，图①、②、③为二倍体细胞，图④、⑤、⑥为超二倍体细胞；
[0032]图3是本发明实施例中经免疫磁珠阴性富集法捕获的恶性胸腔积液肿瘤细胞(WBC)和 CD 133 细胞(CSC)。
【具体实施方式】
[0033]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0034]实施例1实验材料、器材准备与说明
[0035](I)调节离心机的加减速时间，本发明步骤中所有离心加减速时间均一样。符合实验要求的加减速时间为:设置离心机的离心力450g，从转速O升至450g的时间应为40秒，从450g降到O的时间最短应为200秒。
[0036](2)测试水平转子低速离心机是否满足本实验要求，测试方法:取Iml hCTC分离介质至15ml离心管中，将0.5ml外周血与1.5ml Ix hCTC缓冲液混匀后加到Iml hCTC非血源性细胞分离介质顶层，室温离心5分钟(550g)，离心后可见液体明显分层，上层为透明液体，下层为棕红色沉积红细胞。如离心后分层效果差，即该离心机不能满足本实验要求。
[0037](3)每隔一周使用温度计测试干燥箱内干片温度30°C，如干燥箱内实测温度与设定的30°C不相符，按照仪器使用说明校准温度至所需30°C。
[0038](4)